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目的： 通过筛选小细胞肺癌耐药株(H69AR)和化疗敏感株(H69)中具有差异表达的基因，选择表达显著上调的基因TSPAN12进行研究，分析其对癌细胞增殖和药物敏感性的影响及调控机制，进一步丰富小细胞肺癌多药耐药的分子机制，为临床治疗提供理论依据。 内容： 1.分析小细胞肺癌耐药细胞H69AR和敏感株H69中TSPAN12基因表达的差异性，并取另一对细胞H446/CDDP和H446进行验证; 2.分析TSPAN12对SCLC癌细胞药物敏感性和增殖的影响; 3.分析SCLC耐药细胞H69AR和敏感株H69中miR-495的表达差异性及其对TSPAN12的调节作用; 4.分析TSPAN12对β-catenin信号通路活化的影响。 研究方法: 1.cDNA基因芯片分析SCLC多药耐药细胞H69AR和敏感株H69中具有差异表达的基因，选择tetraspanin家族中表达显著差异的TSPAN12，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和western blotting技术验证TSPAN12在两株细胞中mRNA和蛋白水平上的表达差异;取另一对细胞(H446/CDDP、H446)共同验证基因芯片的结果。 2.利用shRNA降低SCLC耐药株H69AR和H446/CDDP中TSPAN12表达水平，CCK-8法分析癌细胞对小细胞肺癌常用化疗药物顺铂(Cisplatin，DDP)和足叶乙甙(Etoposide，VP-16)的敏感性变化;分别利用CCK-8法和平板克隆实验分析下调TSPAN12表达后H446/CDDP细胞的增殖变化;流式细胞术分析shRNA转染前后细胞凋亡和周期的变化。 3.利用miRNA芯片技术分析SCLC耐药细胞H69AR和敏感株H69中差异表达的microRNA，通过生物信息学软件（microRNA.org）分析TSPAN12相关 miRNA，选择表达差异显著的miR-495进行研究，通过qRT-PCR技术验证H69AR、H446/CDDP及其相应亲本中miR-495的表达差异性。 4.通过构建miR-495 mimics和miR-495 inhibitors增加或抑制耐药株(H69AR、H446/CDDP)及其亲本细胞中miR-495的表达水平，利用qRT-PCR技术验证转染效果，然后分别利用qRT-PCR和western blotting技术在mRNA和蛋白水平检验转染后细胞中TSPAN12基因表达的情况。 5.利用qRT-PCR和western blotting技术分析下调TSPAN12后SCLC细胞H446/CDDP中β-catenin在mRNA和蛋白水平上的表达变化;通过免疫荧光实验分析下调TSPAN12前后细胞中β-catenin的分布情况。 统计学分析: 实验结果均经SPSS13.0软件统计。各实验至少独立重复3次，数据以平均数±标准差（(x)±s）表示。耐药株及其亲本间TSPAN12或miR-495表达的比较采用两独立样本t检验;多组间细胞周期或凋亡比较采用one-way ANOVA（方差齐同时）或Welch法（方差不齐时），多重比较采用Dunnett法（方差齐同时）或Dunnetts T3法（方差不齐时）。CCK-8实验结果采用析因设计资料的方差分析，多重比较采用SNK法。以P＜0.05表示有统计学意义。 结果: 1.cDNA芯片结果显示TSPAN12在SCLC耐药株H69AR中的表达是敏感株H69中的3.15倍，qRT-PCR结果（4.66倍，P=0.033）和western blotting结果（1.50倍，P=0.01）;在H446/CDDP和H446细胞中qRT-PCR结果(2.15倍，P=0.028)和westem blotting检测（1.77倍，P＜0.001），验证了基因芯片的结果。 2.设计针对TSPAN12的shRNA寡核苷酸，利用lipofectamin2000转染H446/CDDP细胞，提取总RNA和总蛋白，qRT-PCR实验结果显示转染TSPAN12-1082和TSPAN12-748后细胞中TSPAN12 mRNA水平分别下降至原来的28.6667％(P＜0.001)和65.333％(P=0.019)，结果与western blotting的一致，选取转染TSPAN12-1082进行后续实验。 3.CCK-8法分析癌细胞药物敏感性结果显示:转染TSPAN12-1082后H69AR和H446/CDDP对化疗药物（顺铂和足叶乙甙）的生存率下降，IC50值亦相应减小，但P＞0.05，没有统计学差异。 4.CCK-8法检测转染TSPAN12-1082后H446/CDDP细胞在不同时间点生存率的变化，结果显示TS PAN12下调后H446/CDDP细胞增殖速率显著减慢(P＜0.05);进一步通过平板克隆实验进行验证，显示TSPAN12下调后细胞形成克隆能力显著下降（P=0.022）。 5.利用流式细胞术对转染TSPAN12-1082后H446/CDDP细胞周期的变化，结果发现TSPAN12下调可引起细胞发生G0/G1期阻滞(P=0.01);在细胞凋亡方面，下调TSPAN12可促进药物对细胞诱导的凋亡(P=0.002)。 6.利用miRNA芯片技术发现SCLC多药耐药株H69AR中miR-495较敏感株H69中的明显下调（后者约为前者的4.51倍），qRT-PCR结果(0.32667倍，P=0.017)，取H446/CDDP和H446细胞共同验证，qRT-PCR结果(0.24667倍，P=0.016)，芯片结果得以验证。 7.利用microRNA靶基因预测软件检测发现miR-495的基因序列能与TSPAN12mRNA的3-UTR部分互补配对，转染miR-495mimics后H69AR细胞中miR-495表达上调3.31倍(P=0.018)，qRT-PCR示TSPAN12下调至其亲本的0.67倍(P=0.045)，蛋白水平上TSPAN12下调0.57倍(P＜0.001);而转染miR-495 inhibitors后H69细胞中miR-495表达下调至0.42倍(P=0.017)，TSPAN12在mRNA水平上增加4.76倍(P=0.018)，蛋白水平上增加2.58倍(P＜0.001);在H446/CDDP和H446细胞中重复相同实验也得到类似结果。 8.H446/CDDP转染TSPAN12-1082后，通过qRT-PCR检测，结果显示中β-catenin及其下游基因MYC和CyclinD1表达分别下调0.47倍、0.48倍及0.38倍(P＜0.05)，western blotting结果显示转染TSPAN12后β-catenin下调0.72倍(P＜0.05);在H69和H69AR细胞中重复相同实验得到一致的结果。免疫荧光实验显示TSPAN12下调后细胞核内分布的β-catenin蛋白减少。 结论: 1.TSPAN12在SCLC多药耐药细胞H69AR中表达上调，降低细胞中TSPAN12的表达可以增加癌细胞对化疗药物的敏感性并抑制癌细胞增殖，提示TSPAN12可能是小细胞肺癌发生发展的一个促癌因子，但不是调节小细胞肺癌耐药的关键因素。 2.TSPAN12可以影响SCLC癌细胞周期及其对化疗药物诱导的细胞凋亡。 3.miR-495在SCLC多药耐药细胞H69AR中表达下调，降低或增加miR-495可以下调或上调TSPAN12的表达，提示TSPAN12可能是miR-495的靶基因。 4.降低TSPAN12在癌细胞中的表达可以下调β-catenin及其下游基因的表达，并抑制β-catenin蛋白向细胞核转移，提示TSPAN12可能通过活化β-catenin信号通路来影响SCLC的增殖和凋亡等过程。