巴戟天寡糖促治疗性血管生成作用的实验研究

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背景:冠心病是一种发病率高且严重危害健康的心血管疾病。血管新生疗法即治疗性血管新生在冠心病等缺血性疾病患者中具有潜在的广泛的市场。各种血管生长因子及其转基因治疗的促进血管生成作用已获得认可,但在临床应用中仍存在有效性和安全性等问题。近年来,中医药治疗性血管生成的研究取得了不少成果。研究已证实,补肾中药具有促进血管生成的作用。巴戟天(Radix morinda officinalis,RMO)为补肾壮阳的常用中药。巴戟天寡糖(Morinda officinalis How oligosaccharides,MOO)是巴戟天醇提物水溶性部分中的主要有效成分。导师组以往研究表明,MOO具有明显的抗缺氧复氧损伤、保护心肌作用。然而其是否具有促血管生成作用,其心肌保护作用是否与其促进缺血心肌侧枝循环建立有关,尚未见报道。本课题在导师组以往研究的基础上,旨在通过制备鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)模型及大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)模型,观察应用MOO后CAM与大鼠AMI后缺血心肌血管生成的情况。从治疗性血管生成的角度阐述巴戟天对心血管的保护作用,探讨其机制,并为今后进一步深入研究和探讨巴戟天在心血管方面的作用奠定基础。方法:1.MOO含药血清的制备16只Wistar大鼠随机分为MOO小、中、大剂量组及空白血清组,每组4只。采用4d灌胃法,每d分别按0.7g/kg、1.4g/kg、2.8g/kg灌胃巴戟天醇提物水溶性部分及等容积的生理盐水(normal saline,NS),末次灌胃1h后,腹主动脉取血,分别制备MOO小、中、大剂量含药血清及空白血清。2.MOO促CAM血管生成的实验60只鸡胚随机分为NS组、空白血清组、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)组及MOO小、中、大剂量组,每组10只。孵育7d后建立CAM模型,将NS、空白血清、bFGF(2500U/ml)、MOO小、中、大剂量含药血清分别加在CAM表面的载体上,继续孵育3d后制备CAM标本,体视显微镜下观察血管生成表现,并进行一二级血管计数。3.MOO促AMI后大鼠缺血心肌血管生成的实验40只雄性Wistar大鼠,结扎冠状动脉左前降支,制成急性心肌梗死(AMI)模型,随机分为模型组,麝香保心丸组,MOO小、中、大剂量组,每组8只。另取10只设为假结扎组。其中麝香保心丸组造模后每d按30mg/kg麝香保心丸悬浊液灌胃;MOO小、中、大剂量组造模后每d按0.7g/kg、1.4g/kg、2.8g/kg灌胃巴戟天醇提物水溶性部分;模型组造模后每d灌胃与治疗组同等容积的生理盐水。假结扎组术后不进行任何处理,常规饲养。各治疗组均于造模后24h内开始药物干预。6w后处死,心肌取材,石蜡包埋切片,行一般组织形态学观察,检测各组大鼠缺血心肌中微血管密度(MVD),以及血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白的表达,用病理图像分析系统测定生长因子蛋白表达光密度值,并进行半定量分析。结果:1.CAM血管生成表现NS组、空白血清组血管生成表现均无特异性,或特异性放射状程度低。bFGF组和MOO含药血清组主干血管向载体物靠拢,中小血管明显增生,尤其是小血管以载体为中心呈辐射状生长。2.MOO含药血清对CAM一级、二级血管生成的影响与空白血清组相比,MOO小、中、大剂量组一、二级血管数目显著增加(P<0.05),但药效均弱于bFGF组(P<0.05);与MOO小剂量组相比,中、大剂量组一、二级血管数显著增加(P<0.05),但两者之间无显著性差异。NS组与空白血清组一、二级血管数目之间无显著性差异(P>0.05)。3.心肌切片一般组织形态学观察假结扎组、模型组、麝香保心丸组、MOO小、中、大剂量组均可看到新生的毛细血管。假结扎组可见毛细血管增生不明显;模型组可见少量毛细血管增生;MOO小、中剂量组可见较多增生的毛细血管;麝香保心丸组和MOO大剂量组可见多数增生的毛细血管。4.MOO对AMI后大鼠缺血心肌MVD的影响与假结扎组相比,模型组大鼠MVD显著增多(P<0.05)。与模型组相比,MOO中、大剂量组能显著增加MVD(P<0.05),但作用均弱于麝香保心丸组(P>0.05);MOO小剂量组MVD虽多于模型组,但两者之间无显著性差异(P>0.05)。MOO3个剂量组之间MVD均有显著性差异(P<0.05)。5.MOO对AMI后大鼠缺血心肌VEGF、bFGF蛋白表达的影响与假结扎组相比,模型组、麝香保心丸组、MOO小、中、大剂量组大鼠缺血心肌VEGF、bFGF光密度值显著增高(P<0.05);其中麝香保心丸组增高最明显,与其余各组均有显著性差异(P<0.05)。与模型组相比,MOO中、大剂量组能显著增加VEGF、bFGF光密度值(P<0.05),但作用均弱于麝香保心丸组(P>0.05);MOO小剂量组VEGF、bFGF光密度值与模型组无显著性差异(P>0.05)。MOO中、大剂量组bFGF光密度值和小剂量组有显著性差异(P<0.05),但在中、大剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。MOO3个剂量组之间VEGF光密度值均有显著性差异。结论:1.巴戟天寡糖可明显促进鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成。2.巴戟天寡糖可明显促进AMI后大鼠缺血心肌的血管生成,改善缺血心肌局部的侧支循环。3.巴戟天寡糖可明显促进AMI后大鼠缺血心肌VEGF、bFGF蛋白的表达,这可能是其促血管生成机制之一。
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