本文对肠道病毒71型基因组分析及登革病毒感染人单核细胞进行了研究。本研究分为两个部分：　　第一部分：肠道病毒71型基因组分析。肠道病毒71型（Enterovirus71, EV71），为无包膜的正链RNA病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员。根据EV71-VP1基因序列的差异，将EV71分为3个亚型，其中B和C亚型还可进一步划分，该3个亚型分别为A，B1-B5和 C1-C5。 EV71全基因序列长度为7400 nt左右，包括两端的非编码区，5’UTR（长度为750 nt左右）和3’UTR（长度为85 nt左右），中间为一个开放读码框（Open Reading Frame, ORF），分为三个区域：P1、P2和P3，翻译一个有2193 aa的多聚蛋白，后者被水解成4个结构蛋白VP1(297 aa)、VP2(254 aa)、VP3(242 aa)和VP4(69 aa)和7个非结构蛋白2A(150 aa)、2B(99 aa)、2C(329 aa)、3A(86 aa)、3B(22 aa)、3C(183 aa)和3D(462 aa)。 EV71是引起手足口病（Hand, foot, and mouth disease, HFMD）的主要病原体之一。EV71感染对象大多数为婴幼儿和学龄前儿童，主要表现为手、足等部位疱疹。大多数情况下HFMD为自限性的疾病，但是，少数情况下，EV71可侵犯呼吸系统、中枢神经系统及心血管系统而引起脑炎、心肌炎、肺水肿和弛缓性麻痹等症状。近年来，EV71相关感染性疾病在温州地区有上升的趋势，给当地患儿健康和经济发展发展带来了较大的威胁。　　目的：⑴掌握HFMD标本的采集和分离方法，熟练病毒分离的实验技巧。⑵通过细胞的培养方法观察细胞在病毒感染过程中的病变情况。⑶通过对EV71序列的比对和分析，构建系统进化树，鉴定该6株EV71病毒的基因型别及分析其同其他EV71株之间的亲缘关系。⑷EV71 C4亚型神经毒力相关位点的分析。　　方法：①Vero细胞复苏后铺板，用无血清1640培养基研磨手足口病标本。②用0.22?m过滤器将研磨后的液体过滤后加入处于对数生长期的Vero细胞中。③将细胞上清连续盲传，并观察细胞的病变情况，若细胞发生病变后，则收取上清。④提取上清中的病毒RNA，利用逆转录PCR和PCR扩增病毒序列。⑤利用EV71-VP1序列，对其进行比对和分析，构建VP1的系统进化树，从而确定该6株EV71的基因型别。⑥利用同型别的EV71株，构建系统进化关系树，了解该6株同其他株之间的进化关系。⑦搜集来源于文献报道和数据库中的76株C4亚型EV71（41普通株和35毒力株）全基因序列。⑧82株（76株已报道的EV71株和本研究中的6株）UTR区核苷酸序列和ORF区氨基酸序列的比对。⑨找出普通组和毒力组同位点差异较大的核苷酸和氨基酸位点，利用SPSS进行?2统计学分析。　　结果：⑴成功获得6株EV71全序列，鉴定为C4a型，序列长为7405 bp,5’UTR均为742 bp,3’ UTR均为84 bp：6株 EV71包括2毒力株（11/EV71/Wenzhou/CHN/2014和109/EV71/Wenzhou/CHN/2014，序列号分别为：KT008670和KT008671）和4普通株（4/EV71/Wenzhou/CHN/2014、15/EV71/Wenzhou/CHN/2014、116/EV71/Wenzhou/CHN/2014、120/EV71/Wenzhou/CHN/2014，序列号分别为：KT008669、KT345960、KT008672和KT345959）。序列比对分析得出，2毒力株的全基因序列相似度为98.57％，4普通株相似度为94.67%-96.07%。⑵系统进化和亲缘关系分析：4/EV71/Wenzhou/CHN/2014和15/EV71/Wenzhou/CHN/2014同分离自温州本地的EV71/P1031/2013/China、EV71/P654/2013/China、 EV71/P123/2013/China、 EV71/P40/2013/China及EV71/P16/2013/China亲缘关系较近。然而，116/EV71/Wenzhou/CHN/2014和120/EV71/Wenzhou/CHN/2014同Hubei-WH/CHN/2012（序列号：KP198623，2012年分离自湖北）有较近的亲缘关系。同时，2毒力株同本地株EV71/P156/2013/China（序列号：KP289421，于2013年分离自浙江温州）亲缘关系较近。⑶5’UTR序列比对显示出4个位点：GP151→TP151, AP328→CP328, GP422→AP422和 GP437→TP437在与普通株相比，2毒力株中同时出现变异。在 SLⅡ中，11/EV71/Wenzhou/CHN/2014中GP114→CP114以及2毒力株中GP151→TP151形成相应的特殊二级结构。在FCE和IRES的RNA二级结构中，4个普通株毒力相同而2毒力株与它们不同且各异。⑷3’UTR的核苷酸序列显示出98.8%-100%的同源性，仅仅4个位点出现核苷酸序列的差异：2毒力株中出现TP10→CP10 or AP10的差异。根据比对发现，3’ UTR的二级结构主要取决于7th和10th位核苷酸的差异，其分别对应全序列中7328th和7331th。且4/EV71/Wenzhou/CHN/2014中的CP7和11/EV71/Wenzhou/CHN/2014中的TP10和“TP7或 CP10分别赋予了它们不同与其他的独特RNA的二级结构。⑸6株间的氨基酸序列比对：其结构蛋白中：VP4同源性为100%、VP2同源性为100%、 VP3同源性为99.17%-100%及VP1同源性为97.98%-100%；非结构蛋白中：2A同源性为96.67%-100%、2B同源性为98.99%-100%、2C同源性为98.48%-100%、3A同源性为96.51%-100%、3B同源性为90.91%-100%、3C同源性为98.91%-99.45%以及3D同源性为97.48%-99.78%。此外，在2193个氨基酸位点中，共46个位点出现变异情况。⑹在神经毒性相关核苷酸和氨基酸位点的比对：一共使用了82株（45普通株和37毒力株），比对的结果表明：在5’UTR区共两个核苷酸位点（TP488、CP577），在3UTR区共两个核苷酸位点（CP10和 AP47）以及三个氨基酸位点（GlnP22 in VP1、AsnP57 in2A和IleP56 in3C)可能同EV71的神经毒力有关。　　结论：①本次温州分离的6株EV71均为C4a，属于中国大陆主流行株。②通过比对5UTR相关的重要元件的RNA二级结构的特点，得知SLⅡ、FCE和IRES结构在毒力株和普通株之间存在一些重要的差别，可能在某种程度上直接或者间接地影响着EV71 RNA的复制和转录的效率，从而可能间接地影响着EV71的神经毒力。③6个新的未报道的位点可能同EV71的神经毒力有关：5UTR中的TP488和CP577、2A中的AsnP57、3C中的IleP56以及3UTR中的CP10和 AP47。　　第二部分：登革病毒感染人单核细胞的研究。登革病毒（Dengue virus, DENV）是单股正链RNA病毒，为黄病毒属家族成员。基因组全长11,000 nt。其含有一个开放阅读框，编码3个结构蛋白（C, prM和 E）及7个非结构蛋白（NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b和 NS5）。登革病毒含有4个血清型，分别为DENV1-4，其主要通过白纹伊蚊和埃及伊蚊传播。大部分感染者为自限性，但少数患者可引起登革热或登革出血热（Dengue fever, DF or Severe/fatal dengue hemorrhagic fever, DHF）和登革休克综合征（Dengue shock syndrome, DSS）。登革相关疾病在全世界100多个国家流行，包括非洲、美洲、中东、东南亚和西太平洋，2014年在我国广东省大范围流行。　　目的：⑴了解不同型别的登革病毒感染人外周血单核细胞后，单核细胞转录组的变化。⑵对D2V感染人外周血单核细胞其IL-10分泌影响因素的探究。　　方法：①等密度离心法结合磁珠分选技术分离人外周血单核细胞。②登革病毒感染人外周血单核细胞，对于6个感染组，分别命名为D1V-12h， D1V-24h，D2V-12h， D2V-24h，D3V-12h和D3V-24h，分别于0h、12h和24h收集细胞和上清。③利用细胞总RNA提取试剂盒，提取登革病毒感染后不同时间点的单核细胞总RNA。④逆转录成cDNA后，使用设计好的引物进行实时荧光定量PCR实验，检测相关基因在mRNA上的表达水平的变化。⑤将收集的上清用于ELISA实验，检测单核细胞在登革病毒刺激的作用下相关细胞因子的分析情况。⑥利用单克隆抗体Anti-TLR4阻断单核细胞表面的TLR4后观察细胞因子的分泌情况，在使用 MAPK通路中两种抑制剂，即 P38-inhibitor JNK-MAPK-inhibitor后，通过检测细胞因子的量，阐明这两种蛋白的激活在 IL-10的分泌过程中的作用，通过上述三个位点的阻断，并结合分泌的细胞因子的量说明其关系。　　结果：⑴Mapping的结果：每组的基因序列质量测评得分均在20以上，并且一些短序列的测序结果准确性更是超过99%，且每个时间点Mapped Rates无论在对照组和实验组中均高于0.91，总体的Mapped Rates范围在0.911-0.936之间；⑵维恩分析结果：在同对照组(没有DENV感染)相比之下,176个基因在三个时间点都发生了改变,而相比之下,125个,134个和172个基因分别在DV1、DV2和DV3组发生改变，109个基因在DV1、DV2和DV3组的12h保持不变，159基因改变在DV1、DV2和DV3组的24h保持不变。⑶Gene ontology(GO) and pathway分析：揭示了这些基因在生物过程（Biological processes，BP）、分子功能（Molecular functions，MF）和细胞成分（Cellular components，CC）在登革病毒感染单核细胞过程中的变化。BP在12h显示出补体激活，而24h的过量的表达则显示登革病毒在激活免疫系统过程中的基因表达谱的变化。MF在12h和24h主要反应抗原的结合以及细胞因子和趋化因子的活性。对于CC标注显示，12h主要定位于核糖体和核糖体亚基，而24h检测的表达丰富的基因主要定位于细胞膜上和细胞外；⑷基因差异表达作用网络：在一些特异的基因中存在许多不同的基因共表达模式。我们通过筛选发现了五个基因PGES、GM-CSF、IL-10、IL-19和 IL-20。可能在登革病毒感染人单核细胞早期，在免疫方面起着重要的调节和控制作用。IL2RA被 GM-CSF、IL-10、IL-19和 IL-20靶向激活，而PGES同其他基因之间的作用是相互的；⑸共调节表达的基因：在DENV感染人外周血单核血单核细胞中，GM-CSF、IL-10、IL-19、IL-20等细胞因子的表达水平在RT-qPCR实验中上调，及在mRNA水平上随着感染时间的持续，表达水平是上升的；⑹蛋白水平测定：在对不同感染时间点收集的细胞上清中利用ELAIS技术检测时，也同样观察到上述同mRNA上调趋势相同的情况，即随着感染那的时间的增加，单核细胞在登革病毒刺激后，早期会向细胞外分泌GM-CSF、IL-10、IL-19、IL-20等细胞因子，该4个基因同对照组相比在各个时间点均有上调的趋势，同时该4个上调的细胞因子在RT-PCR和ELISA的实验水平中得到了验证；⑺IL-10的影响因素探究：在利用TLR4和MAPK激酶抑制剂后，对IL-10的分泌有一定的影响，TLR4作为受体，在DENV感染人单核细胞中，TLR4可能作为受体之一介导DENV侵入细胞。JNK和p38 MAPK同时抑制对IL-10的分泌影响较大。　　结论：DENV1-3型感染人单核细胞共上调表达的基因：GM-CSF、IL-10、IL-19和IL-20,上述细胞因子无论在基因还是在蛋白水平均表现出同转录组测序相同的趋势。TLR4-MAPKs同DV2感染单核细胞分泌TL-10相关。