人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hES cells)是一种从人类早期胚胎的内细胞团中分离出来的多能性干细胞。一方面,它能在体外特定的环境下保持不分化的状态并且无限扩增。另一方面,在特殊的诱导条件下,它又能分化成特定的组织细胞,如神经细胞,胰岛素分泌细胞,心肌细胞和造血细胞等,成为神经退行性疾病,糖尿病,心肌梗塞和血液疾病等疑难疾病的细胞替代治疗的重要细胞来源。上世纪60年代开始到90年代末,小鼠,灵长类等哺乳动物的胚胎干细胞陆续建系成功。在此基础上,1998年,美国Thomson等建立了第一个人胚胎干细胞系,于是,研究开发这种具有巨大临床应用前景的生物资源,立即成为生物医学界最具吸引力的热门领域。但是,由于人胚胎干细胞取自人类早期发育胚胎,因此受到伦理道德方面的质疑,研究也一度受到限制,发展受到制约。2009年初,美国食品药品监督管理部门(Food and drug administration,FDA)批准了第一例利用人胚胎干细胞治疗脊髓损伤的临床治疗试验,随着这一临床治疗试验的获批,人胚胎干细胞的研究将又一次成为生物医学领域新的热潮,而相应的伦理规范也将进一步完善,为胚胎干细胞的研究提供依据与支持。本课题组所在的研究所从2001年开始人胚胎干细胞的建系和培养工作,并于2002年成功建立人胚胎干细胞系。但是在课题研究之初,维持人胚胎干细胞体外培养的环境是很不稳定的,出现大量分化,甚至大量死亡的现象。人胚胎干细胞体外培养的体系较其它细胞严苛和复杂,需要事先制备一层有丝分裂灭活的饲养层细胞作为支持,然后才能进行传代。传代后的培养需每天更换添加了各种因子的培养基,直到六天后下一个传代日的到来再重复上述过程。一般来说,这一层有丝分裂灭活的饲养层细胞是鼠胚胎成纤维细胞,它取材比较方便,不存在伦理学争议,但是操作步骤繁杂,而且这种细胞分裂次数有限,每个批次的细胞用完都必需重新制备。本课题的研究就是从标准化鼠源性饲养层细胞的制备入手,分析造成人胚胎干细胞体外培养环境不稳定的因素,探讨人胚胎干细胞体外培养的安全性问题,为人胚胎干细胞临床应用提供安全稳定的种子细胞。本文共包括两大部分:第一部分:标准化鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,mEFs)作为饲养层细胞(feeder cells)的操作程序。利用Microsoft office中的Access软件,建立小型管理数据库。第二部分:探讨丝裂霉素C对人胚胎干细胞体外培养的毒性影响。试图揭示人胚胎干细胞体外核型变化以及DNA损伤修复应答缺陷的机制。