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D—苯丙氨酸是重要手性试剂,是抗肿瘤药、心脑血管药、减肥药及降血糖药的合成原料和中间体;L—茶氨酸是茶叶特征氨基酸,具有降压、镇静、抗癌、减肥等生理作用,二者都是国际市场急需的高附加值新产品。由于化学合成法存在消旋的缺陷;生物合成法有成本高、收率低等不足,本文采用酶法对消旋氨基酸进行拆分,从而获得了高光学纯产物。
本文筛选到产苯丙氨酸脱氨酶菌株NJU110和产氨基酰化酶菌株NJU9980,经鉴定分别为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、刺孢小克银汉霉(Cunnighamella echinulata)。利用NJU110光学拆分DL—苯丙氨酸获得D—苯丙氨酸;利用NJU9980光学拆分DL—苯氨酸获得 L—苯氨酸。
通过正交试验及培养条件优化,得出最佳培养基配方为(g/L):蔗糖20、NH4Cl 10、酵母浸膏2、KCl 1、MgSO41、L—Phe 1;最佳培养条件为:初始pH6.5,摇床转速170r/min,接种量10%,温度32℃,培养时间24h。
对NJU110菌株苯丙氨酸脱氨酶活性进行了研究并得到光学拆分DL—苯丙氨酸的最佳反应条件:pH5.8磷酸缓冲体系,反应温度40℃,转化液中添加1.5%(g/100mL)DL—苯丙氨酸、2‰(v/v)吐温—80和10-5mol/L K+,每50mL加入菌体1g。上述条件下该酶酶活1913U,反应12h后拆分完全,拆分率达100%。转化产物经JK008阳离子交换树脂柱分离精制,收率达73%。精制产品比旋光[a]20D=+34.4°(c=2,水溶液),结合IR分析确认为D—苯丙氨酸。产品质量符合美国USP25标准。
为方便NJU110菌株的进一步研究,本文采用生理生化实验方法及16S rDNA序列分析技术对其进行了鉴定,初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
对NJU9980菌株发酵条件进行研究,得出最佳发酵工艺为:蛋白胨培养基添加0.2% N—乙酰—DL—茶氨酸,接种量1~2%,摇床转速120r/min,培养温度28~30℃,培养时间36h。
NJU9980菌株光学拆分DL—苯氨酸最佳反应条件为:底物浓度0.5mol/L,pH7.0,温度50℃,在上述条件下菌体氨基酰化酶酶活1572U,加入菌体4g/100mL反应30h后,拆分率为92%。产物经JK008阳离子交换树脂柱分离精制,收率84%。精制产品比旋光[α]25D=+8.1°(c=2,水溶液),结合MS、IR证实为 L—苯氨酸,产品质量符合JP2000药典标准。