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玄胡索散由延胡索、补骨脂、当归、牛膝四味药组成,具有“补肾壮骨,活血通络”的功效,是临床治疗骨关节炎的经典复方,疗效确切。但其药效物质基础和作用机制尚不完全明确。骨关节炎是以关节软骨退行性病变为特征的一类慢性关节病,软骨细胞是关节软骨中的唯一细胞,软骨细胞凋亡是骨关节炎发病的重要因素之一。为探究玄胡索散治疗骨关节炎的物质基础和作用机制,本课题提出“靶细胞活性假说”,并结合血清药物化学理论、网络药理学、分子对接技术、分子生物学等方法,探索玄胡索散抗软骨细胞凋亡的潜在药效物质基础和作用机制,为玄胡索散的进一步开发利用提供依据。本研究的内容主要包括以下几个部分:一基于UPLC-QTOF-MS和UPLC-QQQ-MS的玄胡索散入血原型成分分析中药成分复杂,将入血成分作为重要起效化学成分之一进行研究,可过滤掉许多非入血成分。UPLC-QTOF-MS技术以其分析速度快、准确度高、分析范围广被广泛用于中药化学成分分析中。但中药体内入血原型成分分析由于血液样品背景干扰复杂、入血成分含量少等原因,常常会造成检测的困难性。UPLC-QQQ-MS技术具有灵敏度高、准确性、重复性好等特点可避免复杂背景的干扰,本研究结合UPLC-QTOF-MS和UPLC-QQQ-MS技术,并利用MassLynx、UNIFI数据处理软件和标准品验证建立了准确、简便的玄胡索散体内入血原型成分筛查及鉴定方法,对玄胡索散在大鼠血浆中的原型成分进行了快速准确的分析。实验鉴定出玄胡索散灌胃后,大鼠血浆中的20种原型成分,包括君药延胡索10种生物碱类成分、臣药补骨脂8种香豆素和黄酮类成分、佐药当归2种萜类成分。这表明,玄胡索散复方中起主要治病作用的可能为延胡索和补骨脂二味药材当中的成分,牛膝、当归作为佐药,可能对君药和臣药的溶出度、吸收代谢等具有一定的影响,有待后续研究。20种入血成分中Psoralen,Angelicin,Tetrahydropalmatine,Corydaline,Protopine,Berberine 等六种成分在血中含量较高,可能为潜在药效成分。二基于网络药理学的玄胡索散治疗骨关节炎潜在作用机制分析为进一步研究玄胡索散治疗骨关节炎的物质基础及其作用机制,本研究采用网络药理学技术对20种玄胡索散入血原型成分进行了作用靶点和通路预测,确定了玄胡索散治疗骨关节炎的62个潜在作用靶点,KEGG通路分析结果显示,玄胡索散20个入血原型成分治疗骨关节炎的主要作用是抗细胞凋亡和抗炎,与课题假说相一致。其中PI3K-Akt、MAPK信号通路是玄胡索散的主要抗凋亡通路。网络拓扑学分析得到玄胡索散20种入血原型成分治疗骨关节炎的潜在作用靶点与AKT1,FN1,MMP9,MMP2和HRAS等密切相关。三基于分子对接技术的玄胡索散抗软骨细胞凋亡潜在药效物质基础研究本研究结合“靶细胞活性假说”和网络药理学机制研究结果,利用分子对接技术,模拟了玄胡索散20种入血成分与12种潜在药效靶点的结合能力。靶点蛋白的选取分别为:AKT1,FN1,MMP9和HRAS等4种网络药理学关键作用靶点;Caspase-3、Bax、Bcl-2等三种软骨细胞凋亡关键靶点;PI3K、AKT1、mTOR等三种PI3K-AKT通路关键靶点;JUK、ERK、p38等三种MAPK信号通路关键靶点。利用Autodock软件将20种入血原型成分与相应蛋白进行半柔性虚拟对接预测,以结合能△Gbind从低到高排序,选择结合能力较好的化合物作为潜在药效成分。结果显示,20种入血成分与Caspase-3、Bax、Bcl-2、AKT1、PI3K、mTOR等蛋白具有较好的结合活性,其中Psoralen、Tetrahydropalmatine、Angelicin、Berberine、Dehydrocorybulbine 是与 Caspase-3、Bax、Bcl-2 结合能排名前五的化合物,Psoralen、Angelicin、Berberine、Tetrahydropalmatine、Protopine是与PI3K、AKT、mTOR结合能排名前五的化合物。玄胡索散治疗骨关节炎的作用机制可能与 Psoralen、Tetrahydropalmatine、Angelicin、Berberine、Protopine、Dehydrocorybulbine等化合物的抗软骨细胞凋亡作用相关,且这些成分发挥抗凋亡作用的机制可能为PI3K-AKT通路,后续仍需进一步通过细胞实验进行验证。四玄胡索散抗软骨细胞凋亡药效物质初步探究软骨细胞是关节软骨中的唯一细胞,本实验在细胞水平对血清药物化学、网络药理学、分子对接实验所得到的潜在药效成分Psoralen、Angelicin、Tetrahydropalmatine进行了抗软骨细胞凋亡活性初探。采用0.2%Ⅱ型胶原酶消解法提取培养软骨细胞,用1.0 mmol/L硝普钠(SNP)诱导软骨细胞凋亡,采用MTT法对不同浓度的Angelicin、Tetrahydropalmatine、Psoralen等抗软骨细胞凋亡作用进行了初步研究,结果表明,Tetrahydropalmatine 1 μg/mL对SNP诱导的软骨细胞凋亡具有一定的保护作用,Psoralen、Angelicin在0.028 μg/mL～0.14 μg/mL时,对SNP诱导的软骨细胞凋亡具有一定的保护作用。