角膜是一层透明无血管的纤维膜,在组织学结构上角膜共分为5层,从外向内依次为:上皮细胞层,前弹力层,基质层,后弹力层和内皮细胞层。角膜内皮细胞为多边形单细胞层,是维持角膜相对脱水状态,保持角膜透明性和维持角膜厚度的重要因素。在人体内角膜内皮细胞难以再生,若被损伤只能依赖残存细胞形态的改变和移行来进行修复。当损伤超过一定限度造成内皮细胞的密度低于约500-800/mm2时,残存的内皮细胞便不能完全代偿损伤,会导致角膜内皮失代偿,表现为角膜水肿或大泡性角膜病变,严重时甚至失明。角膜移植是目前角膜内皮失代偿最常用也是最有效的治疗方法,然而每年我国角膜捐献的材料极为有限,得到有效救助的病人少之又少。若采取体外培养的方法获得更多的角膜内皮细胞,用于单纯内皮移植或组织工程角膜的构建,可为角膜内皮失代偿病人等多种角膜病变提供新的治疗方案。但是人角膜内皮细胞体外培养增殖传代能力相对有限,而且供体角膜材料仍然是不可缺少的一部分。因此,探求新的具有良好功能的角膜内皮细胞来源,成为急需解决的难题。干细胞诱导分化为角膜内皮细胞成为近年来研究的热点,例如利用胚胎干细胞、骨髓来源的内皮祖细胞、人角膜基质干细胞等。虽然多种干细胞可诱导为角膜内皮样细胞,然而这些研究均存在一定问题,如干细胞取材较困难、动物实验免疫排斥严重、缺乏高等动物实验验证等。皮肤是人体最大的器官,需要更新和修复来维持稳定,而皮肤干细胞则是主要的参与者,研究发现皮肤中包括多种多样的的成体干细胞群,例如表皮干细胞,毛囊干细胞,真皮干细胞等。不管在皮肤领域还是在非皮肤领域的应用中,皮肤中的各种干细胞几乎都具有较高的可塑性。Toma等人从人和啮齿动物的真皮中发现皮肤前体细胞（skin derived precursors,SKPs）,在不同诱导条件下这种细胞能向神经元、神经胶质细胞,骨、软骨细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞转化,是具有多向分化潜能的细胞。更重要的是SKPs被证明与胚胎时期的神经嵴细胞相关,且具有神经嵴细胞的特性,这与角膜内皮细胞的胚胎发育来源相一致。另外,皮肤来源广泛、取材方便,细胞提取方法也不复杂。因此,SKPs是角膜内皮细胞理想的种子细胞来源。角膜移植术是角膜内皮失代偿等多种严重角膜病变的主要治疗方法,主要包括穿透性角膜移植术和角膜内皮移植术。在临床上,穿透性角膜移植术（PKP）是一种重要的手术方式,然而并发症居多,而且免疫排斥率较高。角膜内皮移植术经过角膜瓣下后板层角膜移植术（PLK）,深板层角膜内皮移植术（DLEK）,后弹力层撕除角膜内皮移植术（DSEK）和后弹力层撕除自动刀内皮移植术（DSAEK）,角膜后弹力层内皮移植术（DMEK）几个发展阶段,这项技术已取得的飞速发展。近年来,有学者将体外培养的内皮细胞结合促进角膜贴附性的ROCK抑制剂用注射针注射到受体前房进行内皮移植,动物实验取得了成功,与DSAEK相比效果更好,应用于临床试验也取得令人满意的效果。前房注射法方法简单、易于操作,保留了自身正常的角膜上皮和基质结构,手术创伤小,并发症相对较少,恢复效果好,免疫排斥率也较低,经过研究者的不断努力,将来或可成为临床上治疗角膜内皮功能失代偿的新的手术方法。组织工程角膜（Tissue-engineered cornea,TEC）是在体外模拟天然角膜的组成结构构建出的具有良好的生物学活性的角膜供体替代品,主要由支架与种子细胞构成。支架材料主要分合成材料和天然材料两种,是构建组织工程角膜的重要组成部分。合成材料主要是以有机成分做为原材料的合成物,如胶原、丝蛋白等。天然材料主要是脱细胞的生物组织,是目前组织工程角膜主要的材料来源。脱细胞人角膜基质是TEC最理想的材料,然而由于仍需要捐献的角膜供体,其制备收到限制。近几年来脱细胞猪角膜基质（Acellular porcine cornea matrix,APCM）成为研究的热点,经过学者们不断的研究探索,发现APCM具有良好的组织相容性,且免疫原性较低、生物力学特性与人角膜相似,将其作为组织工程角膜的支架材料最为理想。在APCM的应用上,它可支持多种细胞的生长,可用于构建组织工程角膜前板层、后板层、全层等,动物实验也取得不错的效果,在中国已有用于板层角膜移植的成熟产品。因此,将干细胞诱导获得的角膜细胞与支架材料相结合,构建的出不依赖于供体角膜材料的组织工程角膜应用于角膜移植,可充分缓解角膜材料匮乏的压力,为角膜内皮失代偿和其他多种角膜病变的治疗提供不同的选择方案。因此,本研究中我们首先提取了皮肤来源的前体细胞（SKPs）,在体外对其诱导分化并筛选最佳的诱导方案,成功将SKPs分化为角膜内皮样细胞（CEC-like cells）,体外检测证明其具备正常角膜内皮细胞的形态与表面标志;通过初步探索诱导分化的机制,证实SKPs可能通过Wnt通路分化为角膜内皮样细胞。其次,为验证角膜内皮样细胞在体内的功能,我们将诱导的细胞用前房注射的方法治疗兔角膜内皮失代偿模型,取得了良好的效果;我们进一步进行了恒河猴的移植实验,长期观察发现角膜内皮样细胞功能极佳,与正常内皮细胞相似,能够使角膜恢复透明并能长期保持稳定。最后,我们又探索了以脱细胞猪角膜为支架,以诱导的角膜内皮样细胞为种子细胞构建组织工程角膜植片并用于动物实验的可行性;结果显示角膜内皮样细胞在脱细胞猪角膜基质上生长良好,经过动物穿透性角膜移植后,构建的植片可在短期发挥一定的内皮泵功能。总之,丰富的细胞来源、全新的诱导方法、良好的动物移植实验效果,为角膜内皮失代偿和其他多种角膜病变的治疗提供了新的不同的选择方案,为未来应用于临床展示了美好的前景,为再生医学再填枝叶。[目的]将提取的SKPs作为种子细胞体外诱导其分化为角膜内皮样细胞,寻求获得角膜内皮细胞来源的新方法。初步探索SKPs细胞分化为角膜内皮样细胞的分子机制。[方法]1.皮肤来源前体细胞SKPs的培养:收集重睑术后剩余的皮肤组织,将表皮真皮分离得到真皮,胶原酶消化后细胞筛网过滤,将细胞按一定密度接种在培养瓶中,用SKPs培养液培养。2.人角膜内皮细胞系B4G12细胞的培养及条件培养基的提取:从液氮中取出B4G12细胞复苏,无血清培养基常规培养,胰酶常规消化传代。细胞生长到70%-90%融合时,每12小时收集培养基,滤器过滤除菌,保存在-80℃冰箱备用。3.角膜内皮样细胞的诱导:层粘连蛋白、硫酸软骨素按一定比例包被培养板。将SKPs胰酶消化后枪头吹打成单个细胞,按1×105、5×105、1×106密度接种在包被好的培养板中。（1）条件培养基法:将B4G12细胞条件培养基加入接种好SKPs细胞的培养板中,隔日换液,每天观察细胞形态变化。（2）共培养法:将B4G12与SKPs细胞用transwell小室非接触式共培养,隔日换液,每天观察细胞形态变化。筛选最佳诱导方案。4.角膜内皮样细胞的鉴定:RT-PCR检测角膜内皮样细胞较SKPs在Na+/K+ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Co14a2、Col8a2、Pitx2、FoxC1的表达变化;免疫荧光及Western blotting检测标记物Na+/K+ATPase、ZO-1表达。将诱导的角膜内皮样细胞传代,RT-PCR、免疫荧光及Western blotting评估各标记物的表达。5.SKPs细胞分化为角膜内皮样细胞的分子机制研究:Western blot法检测角膜内皮样细胞与SKPs细胞t-LRP6、p-LRP6、β-Catenin、Gapdh的表达情况。[结果]1.经过筛选可得,以5×105密度接种SKPs用transwell小室与B4G12细胞共培养的方法得到的角膜内皮样细胞在形态和标记物的表达上最佳。诱导4天开始出现多边形细胞,8天时大部分转变成多边形细胞,呈单层镶嵌样排列,为角膜内皮样细胞,与人内皮细胞形态相似,且能稳定传3代。2.RT-PCR示诱导的细胞较SKPs在多种角膜内皮相关标记物如Na+/K+ ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Col4a2、Col8a2表达上随时间变化均有不同程度的增高,在分化相关转录因子Pitx2、FoxC1表达上也不同程度的改变;免疫荧光示诱导的细胞表达Na+/K+ATPase、ZO-1标记物;Western blotting示诱导的细胞Na+/K+ ATPase、ZO-1较SKPs细胞表达量增高。角膜内皮样细胞传代后仍能保持其形态及各标记物的表达。3.Western blot 显示角膜内皮样细胞较 SKPs 细胞在 β-Catenin、t-LRP6、p-LRP6表达上明显增高,说明经过诱导后细胞通过上调LRP6受体和其磷酸化水平激活下游分子,即通过Wnt通路的经典途径诱导分化为角膜内皮样细胞。[结论]SKPs经过与B4G12细胞共培养可诱导分化为角膜内皮样细胞,为角膜内皮细胞提供了新的丰富的来源。SKPs可能通过Wnt通路诱导分化为角膜内皮样细胞。[目的]利用诱导来的角膜内皮样细胞进行角膜内皮失代偿动物模型的角膜内皮移植实验,检测角膜内皮样细胞的体内功能,评估角膜内皮样细胞用于治疗角膜内皮细胞失代偿的可行性。[方法]1.兔角膜内皮失代偿动物模型制作:选取新西兰大白兔,右眼为术眼,利用我们自己制作的装置机械法刮除新西兰大白兔的角膜内皮细胞。HE染色和茜素红染色验证后弹力层的完整性和是否有内皮残留。2.兔角膜内皮移植:将角膜内皮样细胞用Dil标记,调整到一定密度混入100μl培养基中。抽取术眼100μl房水后,实验组将角膜内皮样细胞注射入兔前房,对照组只注射培养基,定期进行裂隙灯、眼压、眼前节OCT、激光共聚焦显微镜等检查。处死动物取角膜行茜素红染色、组织免疫荧光、HE染色等检测。3.恒河猴角膜内皮失代偿动物模型制作:右眼为术眼,机械法刮除角膜内皮细胞。4.恒河猴角膜内皮移植:将角膜内皮样细胞用Dil标记,调整到一定密度混入50μl培养基中,抽取术眼50μl房水后,实验组将角膜内皮样细胞注射入猴前房,对照组只注射培养基,定期进行裂隙灯、眼压、眼前节OCT、角膜内皮镜、B超、房角镜、眼底照相等眼科检查,处死动物取角膜行组织免疫荧光、HE染色等检测。[结果]1.兔角膜内皮移植术后,实验组角膜混浊程度逐渐减轻,可见瞳孔及虹膜纹理,角膜由厚变薄,术后7天角膜几乎完全恢复透明,共聚焦显微镜检查示角膜内皮呈紧密连接多边形,细胞数接近正常;对照组角膜混浊严重,厚度增加,窥不见内皮层。两组眼压均未见明显异常。取角膜行茜素红染色,结果示实验组角膜后弹力层上单层紧密排列的多边形角膜内皮样细胞,对照组后弹力层几乎无细胞。免疫荧光示,实验组角膜内皮面可见Dil红色荧光细胞,表达Na+/K+ATPase,对照组后弹力层裸露。HE染色,实验组角膜厚度基本恢复正常,后表面单层细胞覆盖,对照组角膜水肿增厚,后弹力层几乎无细胞结构。2.猴角膜内皮移植术后,实验组角膜混浊程度逐渐减轻,角膜由厚变薄,术后1个月角膜几乎完全透明,角膜厚度恢复正常;角膜内皮镜检测示角膜内皮样细胞呈多边形,单层紧密贴附在后弹力层上,内皮计数接近正常;前房出现少量渗出和角膜后沉积物,炎症反应较轻且逐渐消失。持续观察1年猴角膜继续保持透明,角膜厚度无明显变化,角膜内皮细胞计数略微减少,未见明显的角膜新生血管,眼压、B超、房角镜、眼底检查均正常。对照组角膜混浊逐渐加重,窥不见内皮层,1月时变成乳白色,随着观察时间延长角膜继续保持混浊。取实验组角膜进行免疫荧光检测示角膜内皮层可见Dil红色荧光,表达Na+/K+ATPase;HE染色示角膜后表面单层细胞覆盖,内皮细胞贴附良好,其他结构未见明显异常。[结论]皮肤来源的角膜内皮样细胞在体内具有与人角膜内皮细胞相似的功能,不仅能在兔角膜内皮移植上取得良好的效果,还能使猴角膜内皮失代偿模型恢复正常并能保持长期稳定,为角膜内皮细胞失代偿的治疗提供了新的选择方案。[目的]探索以诱导来的角膜内皮样细胞为种子细胞,以脱细胞猪角膜为支架构建组织工程角膜植片的可行性,初步评估其进行动物移植的效果。[方法]1.脱细胞猪角膜基质（APCM）及脱细胞猪角膜支架（APCM scaffold,AS）的制作:环钻钻取全层猪角膜,用氯化钠、DNA/RNA酶、PBS进行处理,去除猪角膜的细胞成分制成脱细胞猪角膜基质APCM,切割猪角膜基质前板层至厚度400μm左右,作为脱细胞猪角膜支架AS,置于-20℃保存备用。行HE及DAPI染色进行组织学检测。2.组织工程角膜植片（Tissue-engineered cornea,TEC）的构建:将角膜内皮样细胞一定密度接种在AS上构建组织工程角膜植片TEC,行HE及DAPI染色进行组织学检测,行茜素红染色进行细胞计数。3.兔穿透性角膜移植术:实验组移植组织工程角膜植片TEC,对照组移植脱细胞猪角膜支架AS。术后进行裂隙灯照相、眼压检查,处死后取角膜行免疫荧光染色检测。[结果]1.脱细胞猪角膜基质APCM无细胞残留,胶原排列规则无明显断裂,前弹力层完整;构建的组织工程角膜内皮植片TEC基质面可见贴附良好的CEC-like cells,茜素红染色可见细胞呈单层多边形镶嵌分布,细胞计数与正常兔角膜内皮计数相似。2.兔穿透性角膜移植术后,实验组3周之内角膜逐渐透明,角膜逐渐变薄;对照组角膜逐渐混浊,角膜逐渐增厚水肿。两组术后角膜上皮均逐渐修复,3周后上皮完全覆盖,荧光素染色阴性。观察期间两组术后眼压均未见明显异常,均未见明显的角膜新生血管。取角膜行免疫荧光示,实验组植片基质面覆盖有单层细胞,抗人核抗体和Na+/K+ATPase抗体免疫荧光染色阳性,对照组植片基质面无内皮细胞。[结论]角膜内皮样细胞在脱细胞猪角膜基质上生长良好,可用于构建组织工程角膜植片,进行动物移植实验后组织工程角膜植片可发挥一定的内皮泵功能。