肿瘤的发展和转移是一个多步骤的过程，它包括局部肿瘤生长，浸润，扩散到邻近部位，并形成新病灶。肿瘤的转移和复发是肿瘤患者死亡率的主要决定因素。恶性肿瘤是人类死亡的第二大主要因素，而且有逐渐上升的趋势，在有些发达国家，恶性肿瘤甚至已成为危害人类生命的头号杀手。其中，消化系统的恶性肿瘤占全身恶性肿瘤的60％～70％，结直肠癌和胃癌是常见恶性肿瘤。尽管胃肠肿瘤在手术、化疗、放疗、免疫和生物等各种治疗方法上有了很大提高，但遗憾的是仍然有30％～50％患者出现复发和转移。临床早期胃结肠癌可以通过手术等有效治疗达到根治，但大部分患者就诊时，肿瘤已发生局部浸润或全身微转移甚至转移，治疗后又缺乏一个有效的手段予以评估疗效，检控病情的发展，这是目前导致治疗失败的主要原因。所以如何预防和检测发现肿瘤浸润或转移成为目前肿瘤研究的一个热点。 肿瘤生物学及小分子药物结构领域，阐明肿瘤转移浸润的分子生物学机制和发现、确认关键靶点分子乃当务之急。按Liotta等提出的癌细胞侵袭转移的3步骤假说，从分子水平上将这个过程分为：①粘附；②降解；⑨运动。肿瘤细胞的粘附性和迁移在肿瘤侵袭和转移中起着极为重要的作用。癌细胞的运动能力影响其浸润周围组织和发生远处转移，其中运动因子起着重要作用。许多癌细胞表达运动因子受体，但关于运动因子与结直肠癌侵袭、转移的研究极少。 在对上皮源性肿瘤的研究中发现，有一类被称为受体酪氨酸激酶(RTKs)的跨膜蛋白质在调节细胞生长、分化和生存中起着基础性作用。RON(RecepteurdOrigineNantais)是属于MET原癌基因家族的一种酪氨酸激酶受体(RTK)。体外研究发现RON的激活引起上皮细胞的分化、迁移和基质的侵袭，并可能在肿瘤的发生发展中起重要作用。 RONcDNA最早从角质细胞中被克隆。此基因位于染色体3p21.3——一个在很多肿瘤中经常发生突变的区域。RON是一个180kD的具有酪氨酸激酶活性的杂二聚体，由一个40kD的α链和一个150kD的跨膜β链组成。两条链都是从同一个单链前体经蛋白水解转化而成，并经一个二硫键结合在一起。巨噬细胞刺激蛋白(MacrophageStimulationProtein，MSP)作为RON的唯一配体。有多篇研究显示在人的上皮性肿瘤，如乳癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肝细胞性肝癌和头颈部的鳞癌中均有不同程度的RON的高表达，并在其中部分肿瘤中检测到变异体。 RON的高表达和变异体的出现在肿瘤的发生发展中有何意义、其可能的相关机制是什么?本研究对此进行探究，试图寻找一种监测评估肿瘤浸润、转移和病情发展的特异性强敏感性高的指标。 本论文的内容分以下三部分：第一部分主要试剂配制方法和实验方法介绍试剂配制方法主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)。主要实验方法有：细菌转化，质粒抽提；DNA琼脂糖凝胶电泳；DNA和蛋白提取；质粒转染；WesternBlot；SiRNA；过河实验；Transwell趋化运动实验；Matrigel基质浸润实验等。 第二部分RON受体酪氨酸激酶过表达在大肠癌细胞株浸润/转移中的作用及分子机制的研究 目的：1、观察RON受体酪氨酸激酶过表达对大肠癌细胞株RKO迁移/浸润能力的影响。 2、探索RON过表达引起大肠癌细胞株移动/浸润能力改变的具体分子机制及对Smad信号转导途径的影响。 方法：1、WesternBlot法筛选出低表达或不表达RON的结肠癌细胞株；检测转染前后E-cadherin、Smad2的表达。 2、扩增表达野生型RON的质粒pDR2-wt-RON，以脂质体法转染筛选细胞，并以WesternBlot法鉴定。 3、过河实验和Transwell趋化运动实验检测过表达wt-RON的细胞株迁移和穿膜能力改变，未转染细胞及载体转染细胞作对照。 4、Matrigel基质浸润实验检测转染细胞基质浸润能力的变化。 5、构建shRNA表达质粒，对转染细胞实施RNAi，比较迁移、浸润能力的改变，未转染细胞及对照序列转染细胞作对照。 6、脂质体法转染siRNA表达质粒，针对RON实施RNAi。 结果：1、成功筛选出不表达RON的结肠癌细胞株RKO。 2、成功转染质粒并选择稳定表达wt-RON的克隆，过表达wt-RON的细胞株形态改变，成长梭型。 3、显示过表达wt-RON的细胞株迁移和穿膜能力增强；基质浸润能力增强；E-cadherin表达下降；Smad2的表达增高。 4、针对RON实施RNAi后，过表达wt-RON的细胞株的迁移能力和基质浸润能力均下降；Smad2的表达下调。 结论：1、RKO细胞株转染并过表达wt-RON后，细胞内成分发生重构，E-cadherin表达下降，形态梭型化，迁移和浸润能力增强。提示通过上皮-间质细胞转化(EMT：Epithelial-MesenchymalTransition)机制促进细胞的迁移/浸润能力增加。 2、过表达wt-RON的细胞株Smad2的表达增高，实施RNAi后，其迁移能力和基质浸润能力均下降，Smad2的表达下调。说明可通过Smad途径进行信号转导。第三部分RON受体酪氨酸激酶变异体在大肠癌浸润/转移中的作用及分子机制的研究 目的：1、观察RON受体酪氨酸激酶变异体(RON△160)对大肠癌细胞株RKO迁移/浸润能力的作用。 2、探索RON△160表达引起大肠癌细胞株移动/浸润能力增强的具体分子机制及对Smad信号转导途径的影响。 方法：1、WesternBlot法筛选出低表达或不表达RON的结肠癌细胞株；检测转染前后E-cadherin、Smad2的表达。 2、扩增表达RON变异体(RON△160)的质粒pcDNA3.1-RON△160，以脂质体法转染筛选细胞，并以WesternBlot法鉴定。 3、过河实验和Transwell趋化运动实验检测表达RON△160的细胞株迁移和穿膜能力改变，未转染细胞及载体转染细胞作对照。 4、Matrigel基质浸润实验检测转染细胞基质浸润能力的变化，未转染细胞及载体转染细胞作对照。 5、构建shRNA表达质粒，对转染细胞实施RNAi，比较迁移、浸润能力的改变，未转染细胞及对照序列转染细胞作对照。 6、脂质体法转染shRNA表达质粒，针对RON实施RNAi后，WesternBlot法检测转染前后E-cadherin、Smad2的表达。 结果：1、成功筛选出不表达RON的结肠癌细胞株RKO。 2、成功转染质粒并选择稳定表达RON△160的克隆，表达RON△160的细胞株形态改变，成长梭型。 3、显示表达RON△160的细胞株迁移和穿膜能力增强；基质浸润能力增强；E-cadherin表达下降；Smad2的表达增高。 4、针对RON实施RNAi后，表达RON△160的细胞株的迁移能力和基质浸润能力均下降；Smad2的表达下调。 结论：1、RKO细胞株转染并表达RON△160后，形态变成长梭型，E-cadherin表达下降，细胞内成分重构，可增强迁移和浸润能力；提示通过上皮-间质细胞转化(EMT:Epithelial-MesenchymalTransition)机制促进细胞的迁移/浸润能力增加。 2、表达RON△160的细胞株Smad2的表达增高；实施RNAi后，迁移能力和基质浸润能力均下降，Smad2的表达下调。变异体也可通过Smad途径进行信号转导。全文结论1.RKO细胞株转染并过表达wt-RON后可增强迁移和浸润能力，此作用可为特异性SiRNA所阻断。 2.过表达wt-RON通过上皮-间质细胞转化促进细胞的迁移/浸润能力增加，上调Smad2表达。 3.RKO细胞株转染并表达RON△160后可增强迁移和浸润能力，此作用可为特异性SiRNA所阻断。 4.细胞株表达RON△160可下调E-cadherin的表达、上皮-间质细胞转化增强迁移和浸润能力，上调Smad2表达。 5.RON可以通过过表达和产生变异体方式引起大肠癌细胞株RKO的迁移和浸润，两者均可通过Smad途径进行信号转导。