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目的：随着环境污染对人体健康影响研究日益深入，大气污染物中可入肺颗粒物（PM2.5）成为环境毒理学研究的热点。黑碳（Black Carbon,BC）和重金属（如Fe,Pb,Ni）是PM2.5的关键组分，由于BC独特的理化性质（如粒径小、比表面积大和强烈的吸附性），黑碳在气-粒传输过程中，能极强的吸附有毒化学物质（如重金属和有机物），并在复杂的非均相光化学反应过程中形成二次黑碳粒子，即黑碳-污染物复合体，进一步增加了PM2.5健康效应的复杂性和不确定性。在本研究中，选用黑碳颗粒（BC）和铅离子作为模型材料，通过探究4种黑碳粒子诱发A549细胞的自噬和溶酶体膜损伤，进而为黑碳-铅复合体产生细胞毒性效应的作用机理提供理论依据。
方法：使用商品化黑碳粒子（BC）,并将黑碳氧化改性为羧化黑碳（c-BC），羧化黑碳-铅复合体（c-BC-Pb）和羧化黑碳和铅共暴露（c-BC+Pb），并以未氧化改性的碳黑粒子和铅作为阳性对照。对4种黑碳粒子的理化性质采用元素分析（CEA）、透射电子显微镜（TEM）、电感耦合原子发射光谱（ICP-AES）等进行了表征。
研究了4种黑碳粒子分别暴露于A549细胞后诱发的毒性效应，包括细胞活力的测定、氧化应激、炎症因子、细胞凋亡、细胞周期、自噬及溶酶体膜蛋白表达等指标。其中细胞活力测定通过四唑盐比色法（MTT）分别对4种黑碳粒子暴露A549细胞24h后细胞存活率检测；采取活性氧簇（ROS）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒对比BC、c-BC、c-BC+Pb和c-BC-Pb四种黑碳粒子暴露后A549细胞内的氧化应激水平、细胞膜损伤的影响；采用酶联免疫法（ELISA）检测25μg/mL剂量下四种黑碳粒子染毒暴露24h后细胞炎症因子白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）以及肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平，同时通过RT-PCR分析三种炎症因子的mRNA表达量；采用AnnexinV FITC/PI荧光探针双染法标记四种黑碳粒子暴露24h的A549并通过流式细胞仪（FCM）检测早期晚期凋亡的发生，以及PI探针单染法进行细胞周期检测；采用蛋白质免疫印迹（Western Blot）分别对四种黑碳粒子染毒暴露16h后的细胞蛋白进行电泳检测，选用一抗为自噬关键蛋白LC3B以及溶酶体膜关键蛋白lamp2，二抗为特异性山羊抗兔LgG，放射自显影以检测电泳分离的自噬及溶酶体膜蛋白表达。
结果：通过现代分析技术表征了氧化改性的羧化黑碳（c-BC）及羧化黑碳铅（c-BC-Pb）的理化性质。黑碳粒子诱发的A549细胞活力与LDH水平变化趋势一致，且呈现剂量依赖效应；氧化应激与抗氧化标志物水平的变化趋势也一致。总之，黑碳粒子染毒后细胞活力下降，氧化活性氧（ROS）的水平上升，细胞内氧化还原失衡。此外，4种黑碳粒子诱发细胞的炎症因子（IL-6、IL-8、TNF-α）水平明显的上升，尤其是c-BC-Pb和c-BC+Pb处理组的细胞炎症因子水平与c-BC差异显著，提示铅在诱发炎症反应过程中起关键作用。细胞凋亡的研究结果表明：四种黑碳粒子均能诱发明显的细胞凋亡，且呈现出剂量依赖效应，并且以c-BC-Pb组处理最为显著。细胞周期阻滞的研究结果表明：四种黒碳粒子对细胞周期的阻滞效应均出现在S期，且呈剂量效应，c-BC+Pb和c-BC-Pb粒子阻滞尤为显著，提示引入铅后对细胞周期阻滞有协同效应。采用蛋白质免疫印迹技术进一步研究表明，四种黑碳粒子均可诱发细胞的自噬，而单独的铅离子不能诱导自噬的发生。在高剂量下，c-BC-Pb处理组能显著上调LC3-Ⅱ蛋白水平，而溶酶体膜蛋白lamp2的显著下调。质粒转染和透射电镜的结果进一步验证了自噬所依赖的溶酶体膜结构受损。
结论：四种黑碳粒子均能诱发A549细胞的氧化应激、炎症反应、周期阻滞、细胞凋亡和自噬等一系列的细胞毒性效应。尤其是黑碳-铅复合体（c-BC-Pb）能诱发更严重的氧化应激、细胞早期凋亡和S期阻滞的发生。此外，c-BC-Pb能够显著上调LC3-Ⅱ蛋白的表达和下调溶酶体膜蛋白lamp2的表达，表明c-BC-Pb粒子内化后是以自噬-溶酶体途径在溶酶体内富集，随着暴露剂量与时间的增加，溶酶体膜的损伤加剧，造成溶酶体内含物的释放，进而触发氧化应激和细胞凋亡。因此，自噬和溶酶体功能障碍是羧化黑碳-铅暴露后的协同细胞毒性作用。
方法：使用商品化黑碳粒子（BC）,并将黑碳氧化改性为羧化黑碳（c-BC），羧化黑碳-铅复合体（c-BC-Pb）和羧化黑碳和铅共暴露（c-BC+Pb），并以未氧化改性的碳黑粒子和铅作为阳性对照。对4种黑碳粒子的理化性质采用元素分析（CEA）、透射电子显微镜（TEM）、电感耦合原子发射光谱（ICP-AES）等进行了表征。
研究了4种黑碳粒子分别暴露于A549细胞后诱发的毒性效应，包括细胞活力的测定、氧化应激、炎症因子、细胞凋亡、细胞周期、自噬及溶酶体膜蛋白表达等指标。其中细胞活力测定通过四唑盐比色法（MTT）分别对4种黑碳粒子暴露A549细胞24h后细胞存活率检测；采取活性氧簇（ROS）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒对比BC、c-BC、c-BC+Pb和c-BC-Pb四种黑碳粒子暴露后A549细胞内的氧化应激水平、细胞膜损伤的影响；采用酶联免疫法（ELISA）检测25μg/mL剂量下四种黑碳粒子染毒暴露24h后细胞炎症因子白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）以及肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平，同时通过RT-PCR分析三种炎症因子的mRNA表达量；采用AnnexinV FITC/PI荧光探针双染法标记四种黑碳粒子暴露24h的A549并通过流式细胞仪（FCM）检测早期晚期凋亡的发生，以及PI探针单染法进行细胞周期检测；采用蛋白质免疫印迹（Western Blot）分别对四种黑碳粒子染毒暴露16h后的细胞蛋白进行电泳检测，选用一抗为自噬关键蛋白LC3B以及溶酶体膜关键蛋白lamp2，二抗为特异性山羊抗兔LgG，放射自显影以检测电泳分离的自噬及溶酶体膜蛋白表达。
结果：通过现代分析技术表征了氧化改性的羧化黑碳（c-BC）及羧化黑碳铅（c-BC-Pb）的理化性质。黑碳粒子诱发的A549细胞活力与LDH水平变化趋势一致，且呈现剂量依赖效应；氧化应激与抗氧化标志物水平的变化趋势也一致。总之，黑碳粒子染毒后细胞活力下降，氧化活性氧（ROS）的水平上升，细胞内氧化还原失衡。此外，4种黑碳粒子诱发细胞的炎症因子（IL-6、IL-8、TNF-α）水平明显的上升，尤其是c-BC-Pb和c-BC+Pb处理组的细胞炎症因子水平与c-BC差异显著，提示铅在诱发炎症反应过程中起关键作用。细胞凋亡的研究结果表明：四种黑碳粒子均能诱发明显的细胞凋亡，且呈现出剂量依赖效应，并且以c-BC-Pb组处理最为显著。细胞周期阻滞的研究结果表明：四种黒碳粒子对细胞周期的阻滞效应均出现在S期，且呈剂量效应，c-BC+Pb和c-BC-Pb粒子阻滞尤为显著，提示引入铅后对细胞周期阻滞有协同效应。采用蛋白质免疫印迹技术进一步研究表明，四种黑碳粒子均可诱发细胞的自噬，而单独的铅离子不能诱导自噬的发生。在高剂量下，c-BC-Pb处理组能显著上调LC3-Ⅱ蛋白水平，而溶酶体膜蛋白lamp2的显著下调。质粒转染和透射电镜的结果进一步验证了自噬所依赖的溶酶体膜结构受损。
结论：四种黑碳粒子均能诱发A549细胞的氧化应激、炎症反应、周期阻滞、细胞凋亡和自噬等一系列的细胞毒性效应。尤其是黑碳-铅复合体（c-BC-Pb）能诱发更严重的氧化应激、细胞早期凋亡和S期阻滞的发生。此外，c-BC-Pb能够显著上调LC3-Ⅱ蛋白的表达和下调溶酶体膜蛋白lamp2的表达，表明c-BC-Pb粒子内化后是以自噬-溶酶体途径在溶酶体内富集，随着暴露剂量与时间的增加，溶酶体膜的损伤加剧，造成溶酶体内含物的释放，进而触发氧化应激和细胞凋亡。因此，自噬和溶酶体功能障碍是羧化黑碳-铅暴露后的协同细胞毒性作用。