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目的：造成皮肤组织缺损后创面难以愈合的主要原因包括修复细胞缺乏和促进创伤修复的各种生物活性因子的减少。如何在无足够自体皮肤进行移植等限制下,及时有效的修复难愈创面以尽可能达到恢复皮肤正常功能的愈合,是目前创面临床治疗的难点。因此本研究拟通过AAV介导EGF基因修饰骨髓MSCs,探讨其对于促进创面修复的可能性,为皮肤组织工程种子细胞的来源及转基因技术用于促进创面愈合提供一定的理论基础及实践依据。方法与结果：1.构建携带EGF基因的重组腺相关病毒载体通过RT-PCR从胎盘组织中扩增出175bp大小的EGF基因,将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态细胞。提取此重组质粒DNA并用限制性内切酶EcoRI和Sal I酶切,获得两端分别带有EcoRI和Sal I不同酶切位点的EGF基因片段,最终将其克隆入pAAV-IRES-hrGFP质粒中,通过酶切和测序鉴定,证明成功构建了pAAV-EGF-GFP质粒。2. AAV-EGF病毒的包装、纯化与检测将pAAV-EGF-GFP、pAAV-RC、pHelper 3种质粒共转染HEK293细胞,包装含有EGF基因的AAV-EGF病毒载体；通过“氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”法纯化AAV-EGF;用SDS-PAGE胶电泳检测AAV的纯度,以点杂交检测AAV的滴度。最终证明获得高纯度高滴度的AAV-EGF病毒。3.骨髓间充质干细胞的分离与培养采用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获取小鼠骨髓MSCs,并诱导MSCs向成骨、成软骨和成脂肪三个方向分化,分别采用Von Kossa法、阿尔新蓝丽春红染色和油红0染色方法进行检测。结果表明通过体外原代和传代培养获得的纯化的小鼠MSCs具有向多个方向分化的能力,我们所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。4.AAV-EGF转染MSCs细胞以获取的AAV-EGF病毒转染MSCs细胞,分别于培养3d、14d、27d后提取细胞的总RNA,采用RT-PCR方法检测EGF基因在小鼠MSCs细胞中的分泌表达。结果表明AAV转染了MSCs细胞,介导了EGF基因的体外表达,且EGF基因的表达随着时间的延长而增加。结论：本研究在体外成功地分离培养出具有分化潜能的小鼠骨髓MSCs细胞；构建了携带有人EGF基因的pAAV-EGF-GFP质粒重组体；获得的AAV-EGF病毒可介导EGF基因在小鼠骨髓MSCs中的表达。