研究背景:多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）是一种血液系统的恶性肿瘤,以骨髓内浆细胞克隆性增生为主要特征,大多数患者伴有免疫球蛋白M蛋白的过度生成。随着MM生物学机制的阐明及靶向药物的临床应用,MM治疗已取得较大进展,但大多数可用药物易产生毒副作用和耐药,MM仍为不可治愈性恶性肿瘤。MM在发病过程中表现出热毒的证型,可用清热解毒法进行治疗。黄连解毒汤（Huang Lian Jie Du Tang,HLJDT,黄连、黄芩、黄柏、栀子）具有清热泻火解毒之功效,是清热解毒的经典方剂,在MM临床治疗中已取得一定疗效。小檗碱（berberine,BBR）,是HLJDT君药黄连的主要有效活性成分,可从黄连、黄柏等多种植物的根茎中分离提取的生物碱,具有广泛抗菌谱,常用于治疗痢疾和肠炎。我们前期研究显示,小檗碱能起到抑制MM细胞增殖的作用,但其作用靶点和分子机制尚未阐明。研究目的:1.研究小檗碱在体内外的抗MM作用;2.筛选并鉴定小檗碱抗MM作用的靶标;3.研究该靶标在MM细胞中的作用,明确小檗碱抗MM的分子作用机制。研究方法:1.利用MTT法检测小檗碱对正常小鼠B淋巴细胞（Ba F3）、正常C57BL/6小鼠骨髓细胞、正常人外周血单个核细胞（nh PBMCs）、小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）、MM原代细胞和人MM细胞株（MM.1S、RPMI-8266、U266、NCI-H929）的药物敏感性;2.利用甲基纤维素集落形成法检测小檗碱对MM细胞克隆形成能力的影响;3.利用RPMI-8266细胞在Balb/c nude小鼠构建MM动物模型,检测小檗碱在体内对RPMI-8266细胞增殖能力的影响;4.利用MTT法检测小檗碱与治疗MM一线药物的联合抑制作用;5.利用蛋白酶体活性检测试剂盒和Western Blotting检测小檗碱和硼替佐米处理RPMI-8266和MM.1S细胞后对蛋白酶体活性和泛素化蛋白的影响;6.利用光交联传感器芯片、高效液相色谱和蛋白质质谱联用技术（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC–MS）筛选小檗碱在RPMI-8266和MM.1S细胞中潜在抗MM作用靶点;7.利用Western Blotting比较UHRF1在nh PBMCs、MM原代细胞和人MM细胞中的表达水平;8.利用分子模拟对接小檗碱-UHRF1,并对预测的结合位点进行表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）实验验证;9.利用点突变、蛋白纯化技术纯化UHRF1及其相关结构域,并用SPR实验验证小檗碱与靶蛋白的结合能力的变化;10.利用Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（GSE4581）基因芯片组分析UHRF1表达水平与MM患者预后之间的关系;11.利用q PCR和Western Blotting研究小檗碱对靶蛋白UHRF1的作用机制;12.利用MTT、Western Blotting、si RNA转染、病毒感染法和甲基纤维素集落形成法研究UHRF1在MM细胞中的功能;研究结果:1.小檗碱抑制MM原代细胞、MM细胞株和SP2/0的增殖,对Ba F、nh PBMCs、正常小鼠BM细胞的细胞活性没有明显的抑制效果;2.小檗碱抑制RPMI-8266和MM.1S细胞的克隆形成能力;3.小檗碱抑制Balb/c nude小鼠体内RPMI-8266细胞的生长,且能延长小鼠的存活时间;4.小檗碱与硼替佐米、地塞米松、来那度胺具有联合抑制效应,与硼替佐米抗MM作用机制不同;5.利用光交联传感器芯片和HPLC–MS联用技术筛选到小檗碱81个潜在靶蛋白,分子对接模拟发现UHRF1是小檗碱抗MM的重要靶标并且有三个潜在的结合位点;6.SPR实验验证小檗碱通过第三个结合位点与UHRF1蛋白发生相互作用;7.成功纯化UHRF1及其相关结构域;8.SPR实验验证小檗碱结合于UHRF1的TTD-PHD结构域;9.UHRF1高表达于MM原代细胞和MM细胞,低表达于h PBMCs;且UHRF1高表达提示着MM不良预后;10.小檗碱显著下调UHRF1蛋白表水平,但不改变UHRF1-mRNA表达水平;11.小檗碱诱导UHRF1蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解,并且能激活p16INK4A和p73的表达水平;12.siRNA靶向抑制UHRF1-mRNA表达后,能抑制MM细胞增殖、克隆形成能力和小檗碱的药物敏感性,过表达UHRF1减弱MM细胞对小檗碱药物敏感性;研究结论:1.小檗碱在体内外具有抗MM作用;2.UHRF1在多发性骨髓瘤中起到癌基因的作用,可作为MM的不良预后标志;3.UHRF1是小檗碱抗MM重要的作用靶点;4.小檗碱诱导UHRF1经泛素-蛋白酶体途径发生泛素化降解;5.小檗碱抗MM的作用与UHRF1表达水平有关。