【摘 要】
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细菌性阴道病（Bacterial vaginosis,BV）是最为普遍的阴道疾病,主要因阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis,GV）过度生长导致,会造成患者瘙痒,灼热,疼痛,分泌物异味等症状,也会增加性传播疾病感染以及盆腔炎,不育与早产风险。BV在全球的普遍流行率高达29%,目前主要治疗方法为抗生素,每年用于BV的治疗费用高达96亿美元。阴道加德纳菌的致病性主要体现在其形成生物
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细菌性阴道病（Bacterial vaginosis,BV）是最为普遍的阴道疾病,主要因阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis,GV）过度生长导致,会造成患者瘙痒,灼热,疼痛,分泌物异味等症状,也会增加性传播疾病感染以及盆腔炎,不育与早产风险。BV在全球的普遍流行率高达29%,目前主要治疗方法为抗生素,每年用于BV的治疗费用高达96亿美元。阴道加德纳菌的致病性主要体现在其形成生物被膜（提高耐药性）以及释放毒力因子（使宿主细胞死亡）。这两者的形成会直接或者间接受到环腺苷酸受体蛋白（cAMP receptor protein,CRP）的调控,CRP在结合配体后构象改变,影响对下游启动子DNA的亲和力。针对致病菌CRP结构所设计的药物可用于疾病治疗,所以探索阴道加德纳菌CRP（CRPGv）的结构与变构机制,对寻找潜在药物靶点有重要意义。本文的主要研究成果如下:1.解析得到分辨率2.22 （?）的CRPGv蛋白结构通过对CRPGv蛋白进行表达纯化,得到纯度超过95%的蛋白溶液。经过晶体普筛与优化,得到质量较好的蛋白晶体。收集衍射数据,经结构解析得到2.22 （?）的蛋白结构。结构显示CRPGv主体结构与其同源蛋白类似,但CRPGv前23位氨基酸插入了cAMP结合结构域空腔之中,这与其它大部分同源蛋白处于不同状态;结合DNA的两段α螺旋处于暴露状态,两者距离小于同源蛋白,为35.1 （?）,可能处于有DNA结合活力的状态;结构中不含小分子配体。2.CRPGv不结合已知配体生物信息学分析结果显示,cAMP作为CRPGv配体的可能性最大。但经过ITC,VP-DSC,HPLC,EMSA,CD,胰酶耐受性实验等多种方法鉴定,cAMP不能与CRPGv产生相互作用,并非其配体。后验证cGMP,c-di-GMP,c-di-AMP,OCPA,α-Ketoglutaric acid配体对CRPGv状态无影响,并非其变构配体。这说明CRPGv可能存在新的调控以及变构机制（与未知配体互作进行变构,或者与蛋白互作进行变构调节）。3.CRPGv 结合 TGTGA-N6-TCACA 的 DNA box使用启动子预测网站对GV的基因组序列进行预测,得到得分最高的98条启动子DNA,使用EMSA实验进行验证,CRPGv结合其中Promoter 29。其序列与CRP经典box序列TGTGA-N6-TCACA仅相差1个核苷酸,与经典box序列进行EMSA分析,显示出更强的结合力,进一步证实CRPGv特异性结合TGTGA-N6-TCACA序列,处于活性构象的CRPGv为筛选药物提供了结构基础。4.关键位点的氨基酸突变对CRPGv无影响通过构建突变体蛋白,探究CRPGv变构机制。参照同源蛋白突变体,在CRPGv对应氨基酸位点进行定点突变,构建了 A162D,A162S,D159L,D159N,K166S,N148L/N149I,N149I,R163H,N148L蛋白突变体,通过多方面实验检测,以及使用AlphaFold 2.0进行结构预测,发现可以引起同源蛋白进行结构以及活性改变的氨基酸突变对CRPG、并不适用,未产生结构与功能的变化。
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