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目的:随着医疗技术的发展,皮腔内冠脉血管成形术、溶栓疗法、冠状动脉支架介入等方法的建立和推广应用,使心血管缺血性疾病可以得到有效的血液再灌注,组织器官恢复正常功能。但进一步临床研究发现,缺血再灌注(Ischemia reperfusion,I/R)后组织器官不仅无法恢复正常功能,反而会加剧其损伤。目前研究认为,I/R损伤主要为氧化应激损伤,氧化应激产生大量活性氧自由基,从而引起细胞凋亡,导致组织损伤。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统中发挥主要病理作用的物质,它在全身动脉血压的急性和慢性调节中起着关键作用,是心血管疾病重要的致病因素。有研究表明,Ang II能够介导细胞的氧化应激,导致心肌细胞肥大与凋亡,加剧I/R后的组织损伤,探讨如何抑制AngⅡ介导的心肌细胞的凋亡对于改善I/R后心肌损伤具有重要意义。IL-22(Interleukin-22,IL-22)作为IL-10家族成员,被认为是具有组织保护作用的抗炎因子。近年来研究表明IL-22具有宿主免疫防御、促进组织再生、抑制细胞凋亡等多种功能。因此本研究将探讨IL-22对I/R模型中AngⅡ介导的心肌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法:1、收集临床血清标本,ELISA检测血清中IL-22与AngⅡ的表达情况。构建小鼠缺血再灌注(I/R)模型,小鼠左前降支结扎缺血30分钟后,复灌24小时,取眼球血后处死小鼠,留取小鼠心脏,病理学检测,眼球血室温30分钟凝固后离心取血清,ELISA检测检测小鼠血清中IL-22与AngⅡ的表达情况,Tunel染色检测心肌细胞凋亡。2、用IL-22刺激原代心肌细胞,通过qRT-PCR,免疫荧光技术检测心肌细胞表面IL-22的受体表达情况。将原代心肌细胞分为三组,分别为对照组,AngⅡ处理组,IL-22与AngⅡ联合处理组。使用AngⅡ和IL-22刺激原代心肌细胞12小时后,使用Annexin-V/PI试剂盒检测心肌细胞凋亡的比例;将分离的原代心肌细胞与MCM(Mouse Cardiac Myocytes)小鼠心肌细胞系各分为对照组、AngⅡ处理组、IL-22与AngⅡ联合处理组,使用Western blot技术检测心肌细胞内Caspase-3,Cleaved caspase-3,Caspase-8,Cleaved caspase-8,Caspase-9,Cleaved caspase-9,Bax,Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达情况。3、将原代心肌细胞分为三组:对照组,AngⅡ处理组,IL-22与AngⅡ联合处理组。使用IL-22与AngⅡ处理原代心肌细胞12h,收集细胞培养上清,ELISA检测上清中TNF-α的表达。流式细胞术检测心肌细胞表面Fas、Fas-L的表达。使用ROS特异性荧光探针避光孵育处理后的原代心肌细胞45分钟,流式细胞仪检测细胞中ROS的表达;使用JC-10探针检测原代心肌细胞线粒体膜电位。用ROS抑制剂NAC预处理原代心肌细胞2h后分为:对照组,AngⅡ处理组,IL-22与AngⅡ处理组,流式细胞仪检测心肌细胞内ROS的表达情况,JC-10染色激光共聚焦显微镜成像检测线粒体膜电位变化。使用SOD检测试剂盒检测原代心肌细胞中超氧化物歧化酶的活性。4、机制探索,分组与上述相同,western blot检测Caspase-9,Cleaved caspase-9的表达,并分离原代心肌细胞线粒体与胞质,使用western blot技术分别检测胞质内和线粒体内细胞色素C的蛋白表达。结果:1、小鼠血清ELISA结果显示,I/R组小鼠相对于假手术组和对照组IL-22的水平明显降低,AngⅡ水平明显升高,心肌细胞凋亡;IL-22处理后可缓解由缺血再灌注带来的组织损伤,降低心肌细胞的凋亡与炎性细胞浸润,以及血清中AngⅡ的水平。2、qRT-PCR与细胞免疫荧光检测发现,IL-22处理后心肌细胞IL-22R1与IL-10R2的表达均显著升高。IL-22可以拮抗AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡,下调Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Bax,上调Bcl-2的表达。3、IL-22处理Ang II诱导的心肌细胞损伤模型,培养上清中TNF-α的含量、细胞表面Fas、Fas-L的表达均无明显变化;然而可以显著抑制由AngⅡ引起的心肌细胞线粒体膜电位的降低、ROS含量与SOD活性的增高。使用ROS抑制剂预处理原代心肌细胞亦可以抑制由AngⅡ引起的心肌细胞线粒体膜电位降低。4、IL-22可以抑制AngⅡ引起的心肌细胞胞质内细胞色素C的升高与线粒体内的细胞色素C与Cleaved caspase-9的降低。结论:1、IL-22可以缓解缺血再灌注后的心肌损伤。2、IL-22通过抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡缓解缺血再灌注后的心肌损伤。3、IL-22通过抑制心肌细胞线粒体膜电位降低、抑制线粒体内细胞色素C释放抑制由AngⅡ引起的心肌细胞凋亡。