聚酮化合物(Polyketides)是一类由PKS催化合成的次级代谢产物，具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性，在食品、医药、化工等领域具有广泛的应用。研究表明，动物、植物和微生物都能产生聚酮化合物，其中，微生物是聚酮化合物的最主要来源。研究发现，环境中可培养微生物只占微生物总量的1％，高达99％的不可培养微生物才是微生物的研究主体，这提示尚有巨大的微生物资源至今还未得到充分的开发和利用。随着现代分子生物学技术的发展，基于不可培养微生物研究的宏基因组技术应运而生，该技术绕过传统的实验室纯培养方法，直接提取环境DNA，构建宏基因文库，筛选文库中的目标基因簇，进行异源表达获得目的产物。利用该技术已经发现了多种结构新颖、活性独特的化合物，如蒽环类化合物Arimetamycin A、五角形多酚Calixanthomycin A和Arenimycin C等。因此，利用宏基因组技术从不可培养微生物中寻找新型化合物已经成为微生物研究领域中的一个热点。
　　本研究以采自大连地区的土壤为研究对象，构建土壤宏基因文库，分别根据Ⅰ型PKS和Ⅱ型PKS结构域保守序列设计探针，PCR扩增靶向筛选含有目的基因的克隆子，通过酶切酶连构建生物合成途径特异性的目的基因簇捕获载体，利用酵母转化偶联重组（Transformation-associated recombination，TAR）技术克隆目的基因簇，分别在大肠杆菌和白色链霉菌中进行异源表达，利用有机溶剂萃取表达产物，减压蒸干浓缩得到的发酵粗提物进行TLC及HPLC分析。
　　1.土壤宏基因组文库的构建。土壤去除树枝、石块等杂质，过40目筛，采用CTAB抽提法提取土壤DNA。提取的粗DNA用1％的琼脂糖凝胶（不合EB）电泳纯化、透析袋电洗脱、Millipore超滤管浓缩、异丙醇醇沉并用少量Tris-HCl重悬DNA，测得DNA浓度为soo ng/μL。回收的DNA经末端修复、连入pWEB载体、λ噬菌体包装、侵染Ecoli EC100，获得宏基因文库约含130，000克隆子。
　　2.以PKS基因为靶点定向筛选宏基因组文库。根据Ⅰ型PKS的保守区KS，Ⅱ型PKS的保守区KSα设计简并引物，降落PCR筛选阳性亚库，通过测序及系统发育学分析，针对其中可能编码合成新型化合物的克隆子，96孔板-PCR法回收得到3个含有Ⅰ型PKS(DL3-3、DL5-2、DL9-2)和1个含有Ⅱ型PKS(DL4-1)的单克隆。
　　3.PKS目的基因簇的克隆.根据系统发育学分析，含有Ⅱ型PKS的单克隆DL4-1（登录号:MG820061）与链霉菌属的actinorhodin polyketide化合物聚为一支，自展值为72，亲缘关系较远，推测可能合成与actinorhodin polyketide结构类似的新型衍生物，故本研究对DL4-1单克隆进行异源表达分析。双末端测序文库筛选得到的Ⅱ型PKS生物合成基因簇，并根据测序结果设计特异性引物，PCR扩增获得上下游同源臂，通过酶切酶连将同源臂连入线性化载体pTARa-GJ构建Ⅱ型PKS生物合成基因簇的捕获载体pTARa-DIA-up&down。提取DL4-1质粒并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，获得Ⅱ型PKS目的片段;采用限制性内切酶Pmel及CIP使捕获载体pTARa-DL4-up&down线性化，将酶切得到的Ⅱ型PKS基因片段及线性化的捕获载体共转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CRY1-2中，利用其高效的同源重组机制获得重组转化质粒pTARa-Ⅱ-PKS。
　　4.PKS目的基因簇的异源表达。以大肠杆菌为异源宿主，电转化导入质粒pWEB-Ⅱ-PKS和空载pWEB，PCR扩增验证获得阳性转化子，IPTG诱导表达，有机试剂萃取发酵液，薄层色谱(TLC)分析未发现表达产物;以白色链霉菌为异源宿主，提取酵母重组子质粒pTARa-Ⅱ-PKS，将表达质粒pTARa-Ⅱ-PKS及空载pTARa电转入大肠杆菌EPI300中诱导扩繁，PCR验证阳性后，电转入大肠杆菌S17-1，将目的基因接合转移至白色链霉菌株内并整合到其染色体上，PCR验证阳性后，使用ISP4培养基发酵7d，有机试剂萃取发酵液，TLC分析，与空白对照显示多出一个橙黄色点，HPLC分析，吸收波长在280nm，保留时间在18～19min时，明显多出一条吸收峰，结果表明Ⅱ型PKS基因在白色链霉菌中成功表达，并极有可能产生新型聚酮化合物。
　　该研究利用宏基因技术构建容量为130，000的土壤文库，序列筛选获得一个编码聚酮化合物的单克隆，在白色链霉菌中成功实现异源表达，该研究说明利用宏基因组技术可以实现对聚酮类化合物的定向挖掘，显示了该技术在研究天然产物方面的巨大潜力和广阔的应用前景。