论文部分内容阅读
目的:生殖干细胞(germline stem cells,GSCs)是成体干细胞(Adult Stem Cells,ASCs)的一种类型,其自我更新及分化潜能受到干细胞微环境和多种途径的严格调控。果蝇睾丸生殖干细胞为探讨干细胞自我更新与分化的调控网络提供了十分理想的研究模型。CG5844基因是从果蝇睾丸生殖干细胞微环境中筛选出的新的调控因子。然而,CG5844和干细胞微环境之间的潜在机制联系仍未确定。本课题主要针对CG5844基因在果蝇睾丸生殖干细胞微环境中的功能和机制问题进行研究和讨论。方法:(1)通过UAS/Gal4介导的RNAi途径,两种主要在干细胞微环境中表达的Gal4s(Nos-Gal4和Tj-Gal4)使CG5844的功能丧失,通过标记蛋白的免疫荧光染色检测并分析CG5844在果蝇睾丸干细胞微环境中的表型。(2)使用小干扰RNA(si RNA)在果蝇S2细胞中将CG5844表达沉默,通过磷酸化组蛋白H3(PH3)免疫荧光染色检测细胞增殖,TUNEL免疫荧光染色及流式细胞术检测细胞凋亡以及CCK-8法检测si RNA处理是否影响S2细胞的生长,以探索在体外CG5844的功能。(3)利用CG5844重组质粒转染S2细胞,使其在S2细胞中过表达。同样通过PH3及TUNEL免疫荧光染色、流式细胞术以及CCK-8法检测CG5844过表达对果蝇S2细胞增殖和凋亡的影响。(4)通过CG5844挽救实验进一步验证其表型。(5)通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS),鉴定CG5844结合蛋白,并进行生物信息学分析。(6)通过荧光定量PCR,检测与CG5844高度相关的结合蛋白与CG5844之间的关系。(7)运用果蝇UAS/GAL4系统,通过对质谱结果中所筛选的候选基因核糖体蛋白L6(Rp L6)进行细胞特异性敲减,通过免疫荧光分析Rp L6是否与CG5844具有相似的表型,从而进一步探究CG5844调控果蝇睾丸生殖干细胞微环境的调控机理。结果:(1)激光共聚焦显微镜成像结果显示,果蝇睾丸顶端存在特定缺陷。使用NosGal4使早期生殖细胞中的CG5844敲低,导致睾丸呈微小表型以及生殖细胞完全缺失。而Tj-Gal4介导的CG5844敲低,则导致正常包囊细胞功能障碍和未分化生殖细胞的积累,最终发展成睾丸肿瘤。(2)果蝇S2细胞中敲减CG5844导致细胞生长受到抑制。(3)CG5844过表达显著抑制了果蝇S2细胞的生长。(4)通过沉默CG5844基因所诱导的细胞增殖表型可以通过在S2的细胞中过表达CG5844来挽救,而凋亡表型却无法被挽救。(5)核糖体和核糖核蛋白复合体均为CG5844结合蛋白。且通过富集分析表明,CG5844以较高的可信度参与了核糖体信号转导途径。(6)荧光定量PCR实验结果显示CG5844调节剪接体和核糖体亚基的表达。(7)Rp L6 RNAi完全模仿果蝇睾丸GSCs中CG5844 RNAi所导致的自我更新和分化的相关表型。结论:果蝇体内实验表明CG5844基因是正常生殖细胞和包囊细胞形成和分化所必需的,CG5844的缺乏将导致生殖干细胞的自我更新和分化缺陷。而体外实验表明CG5844参与果蝇S2细胞增殖和凋亡稳态的调节,另外CG5844与核糖体复合物之间高度关联,且CG5844可调节剪接体和核糖体亚基的表达。通过同样的果蝇体内实验发现核糖体亚基Rp L6 RNAi完全模仿果蝇睾丸GSCs中CG5844RNAi所导致的自我更新和分化的相关表型。提示CG5844基因可能是通过与Rp L6相互作用来调控果蝇睾丸生殖干细胞的自我更新和分化。该研究有助于阐明生殖干细胞命运的调控机制,也为阐明生殖细胞肿瘤的形成机制提供新的思路。