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目的:通过建立大鼠视神经损伤模型,研究视神经损伤后轴突中Jarid1b及H3K4me3的表达变化,以了解Jarid1b是否在视神经损伤中发挥一定的作用;建立视网膜神经节细胞(RGCs)的原代培养模型,观察光镜下的细胞形态,并对其纯度进行免疫细胞化学方法鉴定,为RGCs的生理功能或生物学特性研究提供一定的基础。方法:1.选取清洁级成年SD大鼠15只,雌雄不限,每只大鼠均以左眼作为损伤眼,使用显微血管夹在眼球后方约2mm处垂直视神经钳夹约15s,以损伤视神经;以右眼作为对照眼,暴露视神经15s,不进行损伤。损伤或暴露视神经后对大鼠双眼进行眼部检查和FVEP检测,并与损伤前的FVEP结果进行对照,以确保视神经损伤模型成功。在视神经损伤后第3 d、7 d、14 d,分别随机处死每组中的5只大鼠,取左眼和右眼视神经组织制作病理切片分别作为急性损伤组和正常对照组。对切片进行免疫组化染色后,计算两组Jarid1b和H3K4me3的阳性表达率,进行统计学分析。2.选取出生7d以内的SD大鼠,麻醉后摘除眼球,分离出视网膜组织,用木瓜蛋白酶进行充分消化,制成RGCs悬液,以兔抗大鼠巨噬细胞多克隆抗体、山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗鼠IgG(H+L)、Thy-1抗体等对RGCs进行筛选和纯化,在多聚-D-赖氨酸和鼠层粘连蛋白预处理过的24孔细胞培养板中进行培养,并采用抗鼠Thy-1单克隆抗体对培养3d的RGCs进行免疫细胞化学方法鉴定。3.本文采用SPSS22.0进行统计学分析,相同天数不同组内比较采用独立样本t检验,相同组内不同天数比较采用方差分析,急性损伤组内不同天数两两比较采用LSD-t检验,检验水准为0.05,P<0.05说明差异有统计学意义。结果:1.正常对照组视神经轴突中Jarid1b表达中等,不同时间点的表达基本无明显改变。急性损伤组内各时间点Jarid1b的表达均明显低于正常对照组,第3d下降且达到高峰,之后逐渐上升,第7d、14d时Jarid1b表达仍低于正常对照组水平。2.正常对照组视神经轴突中H3K4me3表达较高,不同时间点的表达基本无明显改变。急性损伤组内各时间点H3K4me3的表达均明显高于正常对照组,在第3d升高,在第7d达到高峰,之后逐渐下降,第14d时H3K4me3表达仍高于正常对照组水平。3.光学显微镜下观察RGCs,24h后细胞基本完全贴壁,48h后细胞体积增大,多数细胞可长出突起。第3~5d,细胞突起继续增多增长。第6d,部分细胞出现死亡。第7d,细胞数目明显减少,绝大多数细胞死亡。4.在荧光显微镜下,RGCs可被Thy-1抗体标记成红色,纯度可达87.26%。结论:1.视神经损伤后,轴突中Jarid1b表达下降,H3K4me3表达升高,提示:(1)在视神经损伤中,H3K4me3的表达变化与Jarid1b的表达变化相关;(2)Jarid1b的低表达状态可能是抑制RGCs轴突再生的机制之一;(3)Jarid1b有望成为新的靶点对视神经损伤后修复和再生机制进行深入研究。2.通过此方法培养出的RGCs生长良好,体外存活时间可达7d,纯度较高,可以用于进一步的研究。