目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以持续的呼吸系统症状和气流受限性疾病，其主要病理表现是慢性气道炎症，气道重塑和肺气肿。吸烟是COPD的首要病因。目前针对COPD的肺气肿和气道重塑没有理想的治疗方法。近年来，研究发现香烟烟雾(CS)可诱导肺部细胞内质网应激状态，激活未折叠蛋白反应，并认为未折叠蛋白反应PERK通路参与介导内质网应激相关细胞凋亡程序可能参与香烟烟雾引发肺气肿，而其他两条IRE1和ATF6通路在吸烟所致肺气肿中的变化和机制目前还未见文献报道。核因子Nrf2被发现20年来，在COPD发病中的作用越来越受到研究者的重视，被认为参与决定香烟烟雾导致COPD的易感性。TGF-β1/Smad2.3通路被认为在香烟烟雾诱导的气道重塑中发挥关键作用。胰岛素样生长因子1（IGF-1）被认为在COPD的支气管上皮细胞再生和肌细胞再生中发挥关键作用。熊果酸(UA)是一种广泛存在于天然植物中的五环三萜类化合物，因其具有广泛的抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗纤维化等作用，可能针对COPD发病的多个环节发挥更确切有效的作用。有研究发现熊果酸在热应激诱导的心肌细胞凋亡中，能够通过下调未折叠蛋白反应PERK-CHOP通路减轻内质网应激相关细胞凋亡;在脑缺血模型和肝纤维化模型中熊果酸能够上调抗氧化转录因子Nrf2通路，改善组织氧化应激状态，延缓疾病的进展;在慢性肾病模型中熊果酸能够上调IGF-1的表达，减轻肌肉组织的消耗;此外，熊果酸还被认为是TGF-β1的拮抗剂，但熊果酸对TGF-β1/Smad2.3通路的作用目前不清楚。目前，熊果酸在香烟烟雾诱导肺气肿和气道重塑中的作用和机制还未见文献报道。基于如上分析，本研究探讨熊果酸是否能够减轻香烟烟雾诱导的大鼠肺气肿？熊果酸是否能够通过未折叠蛋白反应，减轻肺组织细胞内质网应激相关凋亡？熊果酸是否能够通过Nrf2通路减轻香烟烟雾造成的肺组织的氧化应激？熊果酸是否能够减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠的气道重塑，及发挥作用是否通过TGF-β1/Smad2.3通路？在香烟烟雾提取物(CSE)诱导的大鼠肺气肿模型中，上述通路是否发挥相同作用，变化趋势？熊果酸的作用？　　方法:本研究分为三部分，我们给予大鼠3个月的香烟烟雾(CS)暴露诱导大鼠肺气肿，并同时给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg体重的熊果酸干预，第一部分实验，探讨熊果酸对大鼠肺气肿、肺组织氧化应激、肺部细胞凋亡、未折叠蛋白反应的三条通路成分、Nrf2通路成分及内质网应激特异性凋亡指标表达的影响。第二部分实验，探讨熊果酸对大鼠气道重塑相关改变及气道重塑的关键通路 TGF-β1/Smad2.3和IGF-1分子表达的影响。第三部分实验，我们给予大鼠香烟烟雾提取物(CSE)腹腔注射3周复制大鼠肺气肿模型，并给予大鼠CSE腹腔注射2周和4周，模拟疾病的不同进程，其中部分大鼠同时给予熊果酸干预。分析肺组织病变的严重程度，未折叠蛋白反应的三条通路、凋亡相关指标、Nrf2、p-Smad2、p-Smad3分子的表达和变化，深入探讨熊果酸对香烟烟雾提取物引发不同程度的肺部病变作用和机制。　　1.熊果酸通过PERK和Nrf2通路减轻香烟烟雾诱导的大鼠肺气肿　　1.1动物分组及肺气肿模型制备健康雄性Wistar大鼠50只，随机分为对照(Sham)组，香烟烟雾暴露(CS)组，熊果酸10mg/kg体重(UA10)组，熊果酸20mg/kg体重(UA20)组，熊果酸40mg/kg体重(UA40)组，每组10只。CS和UA组大鼠给予香烟烟雾暴露3个月，UA组每日熏烟前半小时给予相应剂量熊果酸灌胃，对照组给予空气吸入和溶剂灌胃。密切观察大鼠的一般状态，进食水情况，并在暴露0周、2周、4周、8周、12周称重，比较各组大鼠的体重变化。　　1.2评价肺气肿的严重程度肺组织取材观察肺组织大体改变，肺组织切片HE染色镜下观察肺组织病理改变，并计算平均肺泡内衬间隔(MLI)和平均肺泡细胞数(MAN)，比较各组大鼠肺气肿的严重程度。　　1.3免疫组化染色免疫组化SP法分析肺组织凋亡相关指标Cleaved-Caspase3及氧化应激相关指标8-OHdG的表达，以评价肺组织细胞氧化应激和凋亡情况。　　1.4 TUNEL染色TUNEL染色和DAPI双染法分析各组大鼠肺组织凋亡细胞所占比例。　　1.5谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的检测MDA和GSH试剂盒检测肺组织氧化应激相关指标丙二醛和谷胱甘肽的表达情况，以评估各组大鼠肺组织氧化应激水平。　　1.6免疫印迹Western blot法评估未折叠蛋白反应三条通路及内质网应激相关凋亡特异性指标在不同组大鼠肺组织的表达。同时，观察关键的抗氧化转录因子Nrf2及其下游参与转录调节的抗氧化酶HO1和解毒酶NQO1在肺组织的表达情况，包括Nrf2的核表达，Nrf2的细胞浆表达，总Nrf2表达，全面评估Nrf2通路在不同组大鼠肺组织中的表达。　　2.熊果酸通过TGF-β1/Smad3通路减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠的气道重塑　　2.1动物分组及肺气肿模型制备:同第一部分。　　2.2气道病变肺组织切片HE染色评价大鼠气道血管病变的严重程度，同时评价大鼠气道的厚度。　　2.3气道纤维化肺组织切片Masson染色评价气道周围胶原沉积的情况。　　2.4气道粘液分泌爱先蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色评价气道上皮粘液分泌细胞-杯状细胞的表达情况。　　2.5免疫组织化学免疫组化法分析气道及周围组织8-OHdG、Cleaved-Caspase3、TGF-β1和α-SMA的表达来评价气道组织的氧化应激、细胞凋亡和平滑肌细胞的表达和TGF-β1通路的活化情况。　　2.6免疫印迹免疫印迹法分析TGF-β1/Smad2.3通路的活化情况和IGF-1分子的表达。　　3.熊果酸减轻香烟烟雾提取物诱导的大鼠肺组织细胞凋亡　　3.1动物分组及肺气肿模型制备健康雄性SD大鼠108只，随机分为:对照(Sham)组、香烟烟雾提取物腹腔注射组(CSE)组、熊果酸20mg/kg体重(UA)组，每组再分成3个亚组:2周(2W)组、3周(3W)组，4周(4W)组共9个亚组，每个亚组12只。CSE组、UA组大鼠第1天给予CSE-PBS1毫升腹腔注射，后间隔6天重复，Sham组同时给予PBS1毫升腹腔注射，直至观察终点。UA组每日给予20mg/kg熊果酸灌胃1次，每周6天，Sham组和CSE组同时给予溶剂灌胃，直至观察终点。观察大鼠的一般状态，研究终点称重。　　3.2肺组织病理学改变肺组织取材观察大体改变，肺组织切片HE染色镜下观察肺组织病理改变，并计算MLI和MAN,比较各组大鼠肺气肿的严重程度。　　3.3免疫印迹 Western Blot法分析PERK，IRE1，ATF6通路的激活及凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase12、Cleaved-Caspase9、Cleaved-Caspase8、Cleaved-Caspase3的表达，以及Nrf2、p-Smad2、p-Smad3分子的表达。　　结果:香烟烟雾暴露3个月可明显诱导大鼠肺气肿和气道重塑的相关表现，包括肺组织大体和镜下病理改变、MAN和MLI的变化、气道及血管的厚度、气道及血管壁胶原沉积情况、粘液分泌细胞表达、α-SMA的表达及ECM沉积情况。熊果酸干预可明显减轻香烟烟雾诱导的大鼠肺气肿和气道重塑相关改变。熊果酸可降低肺气肿大鼠肺组织的氧化应激、细胞凋亡、α-SMA表达和ECM沉积水平。熊果酸可通过下调未折叠蛋白反应，进而下调内质网应激相关凋亡指标、减轻TGF-β1/Smad3通路的激活、上调Nrf2通路激活起作用。香烟烟雾提取物注射3周和4周可明显诱导肺气肿相关改变，香烟烟雾提取物能够上调未折叠蛋白反应的三条通路，但激活和持续时间不同，香烟烟雾提取物能够激活内质网应激相关凋亡、内源性、外源性凋亡途径和Smad2.3分子的磷酸化发挥作用。熊果酸能够通过影响上述通路的表达起作用。　　1.熊果酸通过PERK和Nrf2通路减轻香烟烟雾诱导的大鼠肺气肿　　1.1熊果酸对大鼠肺气肿、肺组织氧化应激和细胞凋亡的的影响本研究发现熊果酸干预可减轻肺气肿相关表现，包括大体和镜下肺组织病理学改变，及MAN和MLI的变化;熊果酸可降低肺组织氧化应激指标MDA、8-OHdG的水平，并提升GSH的水平;熊果酸能够下调肺组织凋亡相关指标Cleaved-Caspase3的表达和TUNEL阳性细胞肺组织细胞中所占的比例。　　1.2熊果酸对未折叠蛋白反应和内质网应激相关凋亡指标的影响在肺气肿大鼠肺组织中未折叠蛋白反应PERK，IRE1通路分子的表达及活化升高，下游内质网应激相关凋亡指标CHOP、Bax、Cleaved-Caspase12、Cleaved-Caspase3分子的表达上调，Bcl-2表达下调。提示肺气肿大鼠肺组织中未折叠蛋白反应PERK、IRE1通路的激活及其通过引发内质网应激相关凋亡程序诱导大鼠肺组织细胞凋亡。不同剂量的熊果酸干预均可下调PERK、IRE1通路分子的表达，下调内质网应激相关凋亡指标CHOP、Bax、Cleaved-Caspase12、Cleaved-Caspase3分子的表达，上调Bcl-2表达。提示熊果酸干预能够通过未折叠蛋白反应PERK、IRE1通路减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠肺组织内质网应激相关凋亡。　　1.3熊果酸对Nrf2通路的影响在大鼠肺气肿模型中，重要的抗氧化转录因子Nrf2，不论是Nrf2的核表达，Nrf2的浆表达，还是总Nrf2表达，及Nrf2转录调节的下游的抗氧化酶HO1和解毒酶NQO1表达均下调，提示肺气肿肺组织失去Nrf2途径的抗氧化保护作用。而熊果酸干预能够上调Nrf2途径各分子的表达，减轻肺组织的氧化应激，提示熊果酸能够通过Nrf2途径发挥抗氧化保护作用，减轻大鼠肺气肿。　　2.熊果酸通过TGF-β1/Smad3通路减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠的气道重塑　　2.1熊果酸对香烟烟雾诱导的大鼠气道重塑的影响3个月香烟烟雾暴露明显诱导大鼠气道重塑相关改变，包括气道内皮细胞的增生，结构紊乱，气道及血管壁增厚，气道周围大量炎症细胞浸润，气道及血管腔内结构紊乱。而给予熊果酸干预组大鼠气道重塑相关改变明显减轻。　　2.2熊果酸对气道周围胶原沉积的影响香烟烟雾暴露组大鼠气道周围及血管壁大量致密胶原沉积，致气道挛缩、狭窄。熊果酸干预组则上述改变明显减轻。　　2.3熊果酸对气道粘液分泌的影响香烟烟雾暴露组气道黏膜层可见大量杯状细胞。熊果酸干预组气道周围杯状细胞明显减少。　　2.4熊果酸下调气道壁TGF-β1和α-SMA的表达免疫组化法可见气道周围TGF-β1和α-SMA的表达明显升高，给予熊果酸干预TGF-β1和α-SMA的表达下调。　　2.5熊果酸通过减轻TGF-β1/Smad3通路的发挥作用香烟烟雾暴露组大鼠肺组织活化形式的TGF-β1、p-Smad3及α-SMA均表达上调，而熊果酸干预组则上述指标表达下调。　　3.熊果酸减轻香烟烟雾提取物诱导的大鼠肺组织细胞凋亡　　3.1熊果酸对肺气肿大鼠病理改变的影响香烟烟雾提取物腹腔注射3周和4周可明显诱导大鼠肺气肿的相关表现，包括肺组织大体和镜下病理改变，MAN和MLI的变化。熊果酸干预可明显减轻香烟烟雾提取物诱导的大鼠肺气肿的相关改变。香烟烟雾提取物腹腔注射2周大鼠未呈现出肺气肿相关表现，香烟烟雾提取物腹腔注射3周和4周大鼠的体重明显减轻，给予熊果酸干预大鼠体重明显增加。　　3.2未折叠蛋白反应和内质网应激相关凋亡指标的改变我们动态分析香烟烟雾提取物腹腔注射不同时间:2周(2W)、3周(3W)、4周(4W)未折叠蛋白反应三条通路的激活和变化趋势，发现未折叠蛋白反应的三条通路在香烟烟雾提取物刺激下，均能够被激活，但其持续时间不相同:PERK通路在CSE2W、CSE3W、CSE4W组表达均升高，IRE1通路在CSE2W和CSE3W组表达升高，ATF6通路在CSE2W组表达升高;而内质网应激特异性凋亡指标CHOP、Cleaved-Caspase12、Cleaved-Caspase3在CSE2W、CSE3W和CSE4W组表达均上调，提示三条通路均可能参与香烟烟雾提取物诱导的肺组织细胞内质网应激相关凋亡，而在香烟烟雾暴露不同时期内质网应激相关细胞凋亡均能够发挥作用。而内质网应激参与调节的内源性凋亡相关分子Bax在CSE2W、CSE3W、CSE4W表达均上调，而Bcl-2仅在CSE2W和CSE3W表达下调，内源性凋亡相关分子Caspase9在仅在CSE2W和CSE3W激活，外源性凋亡分子Caspase8在CSE3W和CSE4W表达均升高。熊果酸干预均能减轻三条通路的上调，上调Bcl-2和下调CHOP、Bax、Cleaved-Caspase12、Cleaved-Caspase8、Cleaved-Caspase9、Cleaved-Caspase3表达，提示熊果酸在香烟烟雾提取物注射不同时期均能够下调未折叠蛋白反应通路，进而下调内质网应激相关凋亡程序，同时还能够下调内源性和外源性凋亡通路的激活，减轻香烟烟雾提取物诱导的大鼠肺组织细胞凋亡。此外熊果酸还能够缓解香烟烟雾提取物诱导的p-smad2/3的上调，和Nrf2下调。　　结论:　　1.香烟烟雾诱导大鼠肺组织细胞内质网应激相关凋亡可能通过PERK和IRE1两条途径。　　2.熊果酸有减轻香烟烟雾及烟雾提取物所致肺气肿的作用。　　3.熊果酸有减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠气道重塑的作用。　　4.熊果酸通过减轻内质网应激相关细胞凋亡、肺组织氧化应激、气道平滑肌细胞增殖、细胞外基质沉积起作用减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠的肺气肿和气道重塑。　　5.熊果酸能够通过上调Nrf2通路减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠的肺组织氧化应激。　　6.熊果酸通过TGF-β1/Smad3通路减轻香烟烟雾诱导肺气肿大鼠气道重塑相关改变。　　7.熊果酸能够上调香烟烟雾诱导肺气肿大鼠肺组织IGF-1的表达。　　8.熊果酸减轻香烟烟雾提取物诱导的肺组织细胞内质网应激相关凋亡可能通过未折叠蛋白反应的三条通路完成的。　　9.熊果酸减轻香烟烟雾提取物诱导的肺组织细胞凋亡也通过内源性和外源性凋亡途径完成的。　　10.熊果酸能够缓解香烟烟雾提取物诱导的Nrf2下调和p-Smad2、p-Smad3上调