一.研究背景支气管哮喘(简称哮喘)目前在全球范围内有较高的发病率,并呈逐渐上升的趋势,是当今世界威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病,是发达国家中儿童支气管疾病发病率最高的一种。根据世界卫生组织(WHO)发布的报告指出,目前全球约有3亿哮喘患者,其所造成的社会负担超过了结核病和艾滋病的总和。我国的哮喘患者已达3000万以上,其死亡率位列全球第一。因此,支气管哮喘已经成为全球范围内亟待解决的公共卫生难题。哮喘是由免疫、遗传和环境等多重因素共同作用的结果,其发病机制目前尚未完全明了。既往的研究多集中在Th2介导的嗜酸性粒细胞性炎症。近几年,随着遗传学和分子生物学的不断发展,哮喘遗传病因学成为研究的热点。对哮喘遗传机制及其相关基因研究己逐步深入,并证实哮喘是一种多基因遗传病。目前报道已有超过100个基因与哮喘发病相关,如5q31、6p21上的MHC分子,7q、14q上的T细胞受体基因,11q12、11q13、12q13-24、13q14、20p13等。10号染色体上磷酸酶与张力蛋白同源缺失性基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10,PTEN)是1997年由Steck等3个研究小组先后发现的一个具有双重特异磷酸酶活性的抑癌基因,是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN基因定位于10q23.3上,全长200kb,包含9个外显子和8个内含子,编码由403个氨基酸组成的细胞质蛋白,相对分子量为50000。PTEN基因主要通过磷酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K/Akt)信号转导途径的负性调控,对细胞增殖、生长、凋亡、黏附、迁移和血管生长等进行调节,在维持细胞的结构和信号转导等方面起重要作用。目前除第9外显子未发现有基因突变,其余8个外显子均发现有突变,其中第5、第8外显子有较高的突变率。PTEN基因是继p53基因之后发现的人类肿瘤中突变率最高的抑癌基因。目前已在恶性胶质瘤、原发性乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌等肿瘤中证实了存在这种基因的表达异常。PTEN基因及其调控信号转导异常涉及多个系统疾病及恶性肿瘤的发生、发展,因而研究PTEN基因及其介导的信号转导途径可为治疗疾病新策略研发提供一定理论依据。近年,PTEN基因在过敏性气道炎症中的作用也越来越受到关注。韩国学者Yong等通过动物实验研究首次报道了PTEN可能通过抑制哮喘模型鼠气道内嗜酸粒细胞(eosinophils,EOS)脱颗粒和活化,降低IL-4、IL-5的浓度,从而减轻嗜酸性粒细胞炎症和气道高反应性。Lee等研究提示,PTEN可通过下调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,减轻气道炎症和炎性渗出。Adachi等发现,PTEN基因在过敏性炎症反应中通过嗜酸粒细胞存活和趋化的负向调节发挥重要作用。近年国外学者发现PTEN对肺组织干细胞的动态平衡及分化也起重要作用,可对肺损伤起保护作用。国内动物实验研究发现,气道上皮细胞是PTEN主要表达细胞,哮喘大鼠PTEN蛋白表达明显减少,PTEN可减少Th2细胞因子的表达,从而影响Th1/Th2细胞因子的平衡状态；研究发现地塞米松可通过上调PTEN的表达而控制哮喘发作,这可能为地塞米松抑制哮喘气道炎症形成的重要作用机制。多项体外实验发现,上调PTEN表达能有效抑制人气道平滑肌细胞的增殖,可能主要是通过抑制PI3K/Akt信号转导途径而起作用的。目前国内外对于PTEN基因突变与支气管哮喘的相关性研究报道较少。嗜酸粒细胞的浸润是支气管哮喘的重要特征,嗜酸粒细胞是变应性疾病中最活跃的一类细胞。速发型变应性疾病的组织和器官的局部以及渗出液中均有大量的嗜酸粒细胞浸润,这是变应性发作的一个重要特征。嗜酸粒细胞的聚集和活化是支气管哮喘发病机制中的中心环节。多项动物实验通过剔除嗜酸粒细胞基因及人体实验通过使用抗IL-5单抗,使嗜酸粒细胞缺失,均证实了嗜酸粒细胞活化在哮喘的发病中起关键作用。嗜酸粒细胞在Th2类细胞参与的气道过敏性炎症中也起发挥免疫调节作用。它对于哮喘的发作、预后的判断和药物疗效的评价有重要作用,因此嗜酸粒细胞已经成为哮喘治疗的一个有力的标靶。主要由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T辅助细胞(Th细胞)等炎症细胞参与的慢性过敏性气道炎症是支气管哮喘的主要特征之一。CD4+T细胞(即Th细胞)是T细胞的一种重要细胞亚群,是哮喘发生和发展过程中最重要的调控者。未致敏的CD4+T细胞(Th0细胞)在受到抗原刺激后主要分化为Thl和Th2两个细胞亚群。正常人Th1/Th2类细胞因子互相依存和制约,保持动态平衡。近年来由学者提出了Th1/Th2类细胞因子失衡学说,即Th1/Th2细胞平衡失调,机体正常的免疫耐受功能受损,从而导致免疫细胞及其成分对机体自身组织结构和功能的破坏,是哮喘发病的重要机制。Th2类细胞主要通过分泌Th2类细胞因子而发挥致病作用。Th2类细胞因子,以IL-4、IL-5为代表,对血浆IgE水平升高、趋化因子分泌过多、气道嗜酸粒细胞增多、气道平滑肌增生肥大、黏液分泌增多等均起关键作用。Thl类细胞则主要通过分泌干扰素(IFN-Υ)减轻气道过敏性炎症,对哮喘的发病起保护防御作用。IL-4,又称B细胞刺激因子1,是主要由Th2细胞产生的一种细胞因子。是一种多功能的炎性介质,在免疫反应中发挥着重大作用。IL-5是是调节嗜酸粒细胞功能最主要的调节因子,它与支气管哮喘发作时嗜酸粒细胞反应有直接的关系,它在嗜酸粒细胞的募集、活化、趋化及增殖等方面起着重要作用,对过敏反应进程起到关键作用。IFN-y是Th1细胞因子的典型代表,具有调节嗜酸粒细胞的活化、分化和募集的作用,有利于Thl细胞的分化,而抑制Th2细胞的分化,使Th1和Th2两个细胞亚群达到平衡状态,从而使哮喘患者的气道炎症得到控制。二.研究目的本实验拟探讨PTEN基因突变与儿童支气管哮喘的相关性,以及其与嗜酸粒细胞的关系,Thl和Th2细胞相关细胞因子在哮喘发病中的作用,从遗传学和免疫学角度分析哮喘的发病机制,为寻找抑制气道嗜酸性粒细胞性炎症的药物、免疫学疗法及基因治疗靶点提供理论和初步实验依据。三.材料与方法1、研究对象及分组(1)哮喘组：2010年4月到2011年8月于本院门诊随诊的30例哮喘患儿(临床缓解期),男15例,女15例；年龄2-12岁,平均4.3±2.1岁。均符合2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘诊断标准。(2)对照组：2010年4月到2011年8月于本院健康体检儿童30例,男16例,女14例；年龄2-12岁,平均4.5±2.3岁。均无过敏性疾病病史。(3)两组儿童入组前一周均无使用激素及急性感染病史。组间性别、年龄差异均无统计学意义。两组家长均知情同意参加该项研究。2、标本采集哮喘组及对照组儿童均于清晨空腹留取外周静脉血3m1,其中1ml提取全基因组DNA,-20℃冰箱冻存备检；其余做血涂片后制备血清,室温(20-25℃)放置60min,2000r／min离心10min,留取血清-70℃冰箱冻存备检。3、应用DNA测序法检测PTEN基因第5、第8外显子的基因序列(1)采用苯酚／氯仿提取法提取全基因组DNA。(2)设计PTEN基因exon-8及exon-5特异引物。(3)应用PCR技术扩增目的基因。(4)应用DNA测序仪对哮喘组和对照组标本均进行PTEN基因测序。(5)利用DNASIS MAX V3.0软件对DNA序列测定结果进行分析。4、细胞因子检测：采用ELISA法测定哮喘组及对照组血清标本IL-4、IL-5、IFN-Υ。5、嗜酸粒细胞计数：将哮喘组及对照组外周血涂片在细胞计数板上于400倍高倍镜下进行EOS计数。6、数据分析检测结果以均数±标准差(■±s)表示,计数资料采用t检验及Wilcoxon秩和检验,用SPSS13.0统计软件进行统计分析,以P<0.05作为差异有显著意义的检验标准。四.结果1、PTEN基因exon-8及exon-5突变分析哮喘组和对照组PTEN基因第5外显子和第8外显子均未发现基因突变。哮喘组PTEN基因第8内含子的第32个碱基发生突变T→G,突变率为86.7%(26/30)。对照组未发现基因突变。2、外周血涂片嗜酸粒细胞计数结果哮喘组外周血嗜酸粒细胞计数420±126(×106/L)显著高于对照组165±74(×106/L),差异有统计学意义(t=9.538,P<0.001)。哮喘患儿中,根据有无发生PTEN基因第8内含子突变,分为基因突变组(男性12例,女性14例,平均年龄4.2±1.5岁)和基因正常组(男性3例,女性1例,平均年龄5.3±4.7岁),PTEN基因发生突变的哮喘患儿外周血嗜酸粒细胞计数高于无突变的哮喘儿童,差异有统计学意义(W=25.500,P=0.026)。3、血清细胞因子IL-4、IL-5和IFN-Υ水平检测结果哮喘组与对照组比较,IL-4水平158.23±28.76(ng/L)高于对照组70.16±15.35(ng/L),差异有统计学意义(t=14.794,P<0.001)。哮喘组与对照组比较,IL-5水平45.32±12.15(ng/L)高于对照组27.58±7.34(ng/L),差异有统计学意义(t=6.842,P<0.001)。哮喘组与对照组比较,IFN-Υ水平32.21±6.25(ng/L)低于正常对照组53.65±13.19(ng/L),差异有统计学意义(t=8.047,P<0.001)。五.结论本课题通过基因测序、外周血细胞计数及血清细胞因子检测等技术,研究了PTEN基因突变与儿童支气管哮喘的相关性,其与嗜酸性粒细胞数量的关系,以及IL-4、IL-5、IFN-Υ在哮喘发病中的作用。通过研究我们得到以下结论：1、哮喘儿童的PTEN基因第8外显子无基因突变,但第8内含子存在具有显著意义的点突变：第32个碱基突变(T→G),突变率高达86.7%；2、哮喘组儿童外周血嗜酸粒细胞计数明显升高；3、PTEN基因发生突变的哮喘患儿外周血嗜酸粒细胞计数高于无突变的哮喘儿童；4、哮喘儿童PTEN基因第5外显子未发现突变；5、哮喘儿童存在Th1/Th2细胞亚群功能失衡,即Th2细胞功能亢进及Thl细胞功能低下。