背景和目的:结肠癌目前是全球的第三大恶性肿瘤,它的发病率和致死率在癌症中排名第二。因为其发病隐匿,多数结肠癌患者在肿瘤晚期阶段才能被诊断,尽管手术方案和化学治疗手段已经在不断地完善和提高,该类患者的预后仍然不佳,远处转移依旧是其死亡率增高的主要原因,因此早期的诊断和治疗对于改善患者的预后有着重要的意义。在结肠癌中进一步探讨关于肿瘤转移的分子机制,同时开展具有针对性的防治措施是目前研究的热点问题。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位起始,经过比如淋巴道、血管、种植等各种不同途径,最后到达并定植到其他部位,逐渐形成与初始部位相同类型的肿瘤,且继续不断生长的过程。因此各类恶性肿瘤患者死亡最常见和直接的原因仍旧是肿瘤转移。对于参与转移过程的分子机制的研究是制定该类疾病治疗方案的关键。越来越多的研究表明,肿瘤转移的特征主要是通过膜转运来实现的。具体而言,膜转运可以通过控制质膜上的受体和转运蛋白的位置来调节细胞的营养吸收和细胞外的分子信号转导。它可以稳定细胞的极性、形态和结构,从而稳定器官的功能和结构。因此膜转运对于细胞的增殖、分化和凋亡,特别是肿瘤的发生发展至关重要。膜转运调控蛋白EHD2是一种含有EH结构域,在C端包含543个氨基酸残基的蛋白。它是最近发现的EH蛋白中EHD亚型1-4家族成员中的一员。EHD2在各种细胞中广泛表达,但是近年来在一些实体肿瘤细胞中却发现EHD2表达的缺失,推测其可能作为一种抑癌基因参与各类肿瘤的发生发展进程,如食管鳞癌、乳腺癌、肝细胞肝癌等,并且目前在肿瘤中的具体作用机制尚未完全明确。当前,对EHD2在结肠癌中的表达情况及相关的分子机制的国内外研究报道尚且少有。本课题组首先通过UALCAN数据库查询并分析EHD2在结肠癌中的表达情况,然后在人结肠癌石蜡组织标本中进一步验证EHD2的表达情况,通过随访资料分析EHD2与临床病理参数之间的相关性。接着构建EHD2的慢病毒过表达质粒,在体外结肠癌细胞中感染慢病毒后检测过表达EHD2对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭等细胞生物学行为的影响。最后通过构建裸鼠皮下移植瘤模型,在体内进一步验证EHD2对结肠癌生长的影响。第一部分 EHD2在人结肠癌组织中的表达及临床意义目的:在人结肠癌标本组织中检测EHD2的表达情况,并分析EHD2的表达与临床病理参数的相关性。方法:通过UALCAN数据库分析EHD2在结肠癌中的表达情况。对石蜡切片进行HE染色,同时采用免疫组织化学技术检测90对结肠癌组织及相对应的癌旁组织石蜡切片标本中EHD2蛋白的表达情况。初步分析EHD2的表达与临床病理参数之间的相关性,并且随访患者的生存资料,对有随访结果的病例做Kaplan-Meier生存曲线分析。EHD2与结肠癌患者预后的关系应用Log-Rank检验、Cox 比例风险模型分别进行单因素分析和多因素分析。结果:（1）通过对UALCAN数据库的结果分析发现EHD2在结肠癌组织中的表达显著低于正常结肠组织（P=0.008）,尤其在结肠腺癌中表达明显降低（P=0.004）。（2）EHD2主要表达于结肠癌细胞的细胞质和细胞膜,在90对结肠癌石蜡切片组织中,EHD2的表达显著低于相对应的癌旁组织。在结肠癌组织的标本中,有66例系EHD2低表达,低表达率为73.3%,而在癌旁组织中,EHD2表达升高。（3）通过对90例结肠癌患者临床病理参数进行统计学分析,发现EHD2的表达与TNM分期、淋巴结转移、病理组织学分化密切相关（P＜0.01）,但是与年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性（P＞0.05）。利用单因素分析显示TNM分期（P＜0.001）、淋巴结转移（P＜0.001）、EHD2的表达（P=0.035）与患者的预后均有相关性。采用Cox比例风险模型对临床病理参数进行多因素生存分析发现,EHD2和TNM分期可以作为结肠癌的独立预后因素（P=0.042,P=0.036）。Kaplan-Meier生存曲线提示EHD2的表达水平和患者的生存率呈正相关（P=0.029）。结论:EHD2在结肠癌组织中的表达明显降低,并且与患者的预后及生存率显著相关,提示EHD2可能在结肠癌的发生发展中扮演抑癌基因的角色,并可以作为判断预后的指标。第二部分 EHD2对结肠癌细胞生物学行为的影响及分子机制初步探究目的:在体外细胞模型中探究EHD2对结肠癌细胞生物学行为如增殖、迁移、侵袭、凋亡等能力的影响。方法:在体外细胞模型中,应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测 EHD2 在 HCT116、HT29、SW480、SW620 这 4 种结肠癌细胞中的mRNA及蛋白水平内源性表达的情况。在结肠癌细胞系SW620中感染EHD2慢病毒过表达质粒,然后分别通过Western blot和qRT-PCR在结肠癌细胞系SW620中验证感染的成功性,同时检测当EHD2过表达时,与上皮间质转化（EMT）相关的标志分子E-cadherin、N-cadherin、Snail的表达变化情况。构建划痕实验和Transwell小室实验模型观察当EHD2表达上调时结肠癌细胞迁移、侵袭的能力。应用CCK8、克隆形成实验检测当EHD2表达上调时结肠癌细胞的活力及增殖能力。利用流式细胞术及Annexin V-APC单染法观察当EHD2表达上调时结肠癌细胞周期分布及细胞凋亡情况。结果:（1）SW620细胞株中EHD2在mRNA和蛋白水平的表达相较于在其他三种结肠癌细胞株中的表达是相对较低的。（2）成功构建EHD2基因过表达的稳转株,在SW620细胞株中感染慢病毒过表达质粒后在mRNA及蛋白水平检测EHD2的基因量显示与对照组相比明显增加。（3）在过表达EHD2的结肠癌细胞中检测到与EMT相关的分子标志物E-cadherin与EHD2的表达呈正相关,而N-cadherin、Snail与EHD2的表达呈负相关。（4）细胞划痕实验评估细胞迁移能力,结果提示与对照组相比,EHD2表达上调后结肠癌细胞的划痕愈合能力减慢。Transwell实验评估细胞侵袭能力,结果提示与对照组相比,过表达EHD2后结肠癌细胞的侵袭能力减弱。（5）CCK8细胞增殖实验评估细胞活力,结果提示与对照组相比,在同一检测时间点内,过表达EHD2后结肠癌细胞增殖活力减弱。克隆形成实验评估细胞增殖能力,结果提示与对照组相比,过表达EHD2的结肠癌细胞其细胞集落数明显减少。（6）细胞流式周期及细胞凋亡实验提示与对照组相比,过表达EHD2后细胞周期被阻滞在G2/M期,并显著促进细胞的凋亡。结论:在体外细胞模型中,EHD2基因导致结肠癌肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制,并且会促进细胞的凋亡,同时EHD2与EMT标志分子E-cadherin的表达呈正相关,提示EHD2可能通过参与EMT过程从而影响结肠癌的发生发展。第三部分 EHD2对结肠癌裸鼠皮下异位移植瘤模型中肿瘤生长的影响目的:在裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型中研究EHD2对肿瘤生长的影响。方法:分别将感染EHD2慢病毒的结肠癌细胞、感染空载体的结肠癌细胞接种入裸鼠皮下,利用皮下成瘤模型比较过表达EHD2及对照组中裸鼠成瘤的体积和瘤体重量的变化。在瘤体制备的石蜡切片上分别采用HE染色和Ki-67的免疫组织化学染色。利用Western blot检测过表达EHD2的瘤体组织蛋白中上皮间质转化（EMT）相关的标志分子E-cadherin、N-cadherin、Snail的表达变化情况。结果:在裸鼠成瘤模型中,EHD2过表达组裸鼠的肿瘤体积小于空载组,瘤体重量低于空载组。HE染色结果提示剥离的瘤体组织具备肿瘤细胞特征。免疫组织化学结果提示过表达EHD2后肿瘤增殖指标Ki-67的表达量降低。并且EHD2与EMT标志分子E-cadherin的表达呈正相关,而N-cadherin、Snail与EHD2的表达呈负相关。结论:EHD2基因在体内可抑制结肠癌肿瘤细胞成瘤的能力,并且可能和阻止EMT进程相关。