【摘 要】
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目的:探讨胃癌肿瘤微环境中M2型巨噬细胞通过IL-6/STAT3信号通路介导肿瘤细胞干性在胃癌演进过程的作用机制。方法:运用生物信息学CIBERSORT对TCGA中胃癌数据进行筛选并分析肿瘤微环境中各免疫细胞的分布特征;应用多重荧光免疫组化（m IHC）标记并验证关键免疫细胞在胃癌进展和预后评估中的作用。应用免疫组化法检测胃癌干性标记物（CD44,ALDH1）的表达情况,分析其在胃癌浸润、转移及预
【基金项目】
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国家自然科学基金（81460363）； 国家自然科学基金:肿瘤相关巨噬细胞调控肿瘤干性在哈族食管癌侵袭转移中的作用机制研究（81760428）； 国家自然科学基金:HIF-1α介导肿瘤相关巨噬细胞促进食管鳞癌浸润转移的作用机制研究（81960435）；
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目的:探讨胃癌肿瘤微环境中M2型巨噬细胞通过IL-6/STAT3信号通路介导肿瘤细胞干性在胃癌演进过程的作用机制。方法:运用生物信息学CIBERSORT对TCGA中胃癌数据进行筛选并分析肿瘤微环境中各免疫细胞的分布特征;应用多重荧光免疫组化（m IHC）标记并验证关键免疫细胞在胃癌进展和预后评估中的作用。应用免疫组化法检测胃癌干性标记物（CD44,ALDH1）的表达情况,分析其在胃癌浸润、转移及预后判断中的作用。运用无血清培养法富集胃癌细胞（AGS,MKN-45）中球体细胞,q RT-PCR、Westerblot技术检测其干性指标（CD44,ALDH1）的表达;利用佛波酯（PMA）以及IL-4/IL-13诱导单核细胞（THP-1）转化为M2型巨噬细胞并用q RT-PCR检测其表型;胃癌细胞（AGS,MKN-45）及成球细胞分别和M2型巨噬细胞共培养,q RT-PCR、Westerblot技术和细胞功能实验（CCK8和Transwell迁移、侵袭实验）分别检测并分析M2型巨噬细胞对胃癌细胞、球体细胞干性（CD44,ALDH1）特征和恶性生物学行为的影响;应用生物信息学和二代测序NGS筛选M2型肿瘤相关巨噬细胞参与胃癌干性调控的因子和信号通路并用q RT-PCR进行验证,应用中和抗体及STAT3通路抑制剂分析M2型肿瘤相关巨噬细胞介导STAT3通路在胃癌干性调控中的作用。结果:1.生物信息学数据显示胃癌肿瘤微环境不同表型的巨噬细胞、T细胞及嗜酸性粒细胞等与正常组织存在明显分布差异性（P均<0.05）,其中各亚型巨噬细胞（M0,M1和M2）、CD8+T细胞、活化的肥大细胞和静息树突状细胞均与肿瘤Grade分级密切相关（P均<0.05）;M2型巨噬细胞和嗜酸性粒细胞均与肿瘤Stage分期密切相关（P均<0.05）;生存分析发现M2型巨噬细胞与患者不良预后关系密切（P<0.05）,CD8+T细胞和活化的CD4+记忆T细胞与患者预后较好密切相关（P均<0.05）。多重荧光免疫组化（m IHC）显示CD4+T细胞、CD8+T细胞和Tregs细胞的浸润与胃癌Grade分级密切相关,CD8+T细胞和CD163+M2型肿瘤相关巨噬细胞的浸润与胃癌Stage分期密切相关,M2型肿瘤相关巨噬细胞数量的增加还与胃癌淋巴结转移密切相关（P均<0.05）;生存分析显示Tregs细胞和M2型肿瘤相关巨噬细胞的高度浸润与胃癌患者的不良预后关系密切（P均<0.05）,CD4+T细胞和CD8+T细胞的高度浸润与胃癌患者预后较好密切相关（P均<0.05）。2.胃癌干性指标（CD44,ALDH1）的表达明显高于癌旁正常组织（P均<0.05）,CD44,ALDH1的表达与M2型肿瘤相关巨噬细胞呈明显正相关（P均<0.05）,且其过表达与肿瘤淋巴结转移、Stage分期和组织分级等临床参数密切相关（P均<0.05）。3.胃癌无血清成球细胞CD44和ALDH1的表达明显高于本底细胞（AGS,MKN-45）（P均<0.05）;与M2型巨噬细胞共培养的胃癌细胞（AGS,MKN-45）,其CD44,ALDH1的表达明显增强,增殖、侵袭和迁移能力均明显提高（P均<0.05）;与M2型巨噬细胞共培养的胃癌成球细胞,其CD44,ALDH1的表达也明显增强,恶性生物学行为也均明显提高（P均<0.05）。4.二代测序转录组数据显示胃癌细胞在和M2型巨噬细胞共培养后,JAK-STAT、PI3K/AKT、NF-KB等信号通路处于明显激活状态,体外共培养体系验证发现STAT3信号通路更为相关,应用Stattic阻滞STAT3信号通路,发现M2型巨噬细胞介导胃癌细胞（AGS,MKN-45）及成球细胞CD44,ALDH1的表达明显下调,其增殖、侵袭和迁移能力均明显下降（P均<0.05）。5.通过文献和分析转录组数据确定IL-6和IL-10可能是STAT3通路激活的重要因素,并通过q RT-PCR实验确定IL-6为介导STAT3通路的关键因子,随后利用实验进一步证实了抑制IL-6/STAT3通路会促使M2型巨噬细胞介导胃癌细胞（AGS,MKN-45）的干性标记表达明显下调,其增殖、侵袭和迁移能力也出现明显下降（P均<0.05）。结论:（1）胃癌肿瘤微环境高密度M2型肿瘤相关巨噬细胞和Tregs细胞的分布特征预示肿瘤的高侵袭性和患者的不良预后;（2）M2型肿瘤相关巨噬细胞介导IL-6/STAT3信号通路参与胃癌细胞干性的调控及肿瘤的演进过程。
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