胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,名列全球第二大癌症死亡原因。在我国,胃癌发病居所有恶性肿瘤的首位,死亡人数约占所有恶性肿瘤死亡人数的25%-30%。多数学者认为胃癌的发生是多种环境因素如饮食因素、宿主因素如幽门螺杆菌感染和遗传突变相互作用的结果。深入研究胃癌发生的分子机理将会有助于开发新的胃癌诊断和治疗方法。临床研究和体外研究表明PI3K/Akt信号通路的激活参与调控胃癌细胞的增殖和迁移,且与胃癌的进程、转移和预后密切相关。PTEN作为最重要的抑癌基因可以特异性地抑制PI3K/Akt信号通路的激活。本课题组在以前的研究中研制了腺胃上皮细胞中特异性PTEN基因敲除小鼠,该小鼠腺胃上皮过度增生并发生胃癌,较好的模拟了人类胃癌发生发展过程。microRNA(miRNA)是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA,主要通过不完全互补结合到靶基因mRNA的3’非编码区,阻止mRNA的翻译或降低mRNA的稳定性,抑制目的基因的表达。越来越多的研究显示,miRNA异常表达与临床胃癌的发生、分型、进展、转移和预后相关,并通过调控靶基因的表达参与胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和抗药性等过程,但对于miRNA受何种机制调节知之甚少。在本研究中,我们主要利用腺胃上皮细胞特异性敲除PTEN基因的小鼠胃癌模型筛选受PI3K/Akt信号通路调节的miRNA,对这些miRNA影响胃癌细胞增殖、迁移和凋亡等功能进行验证和评价,并筛选和鉴定功能靶分子。同时在小鼠胃癌模型和人类胃癌标本中验证miRNA与PI3K/Akt信号通路及下游靶基因的相关性,以检验其临床意义。利用这种特有的小鼠模型,我们能够实现在肿瘤发生早期阶段筛选受Akt调节的miRNA,从而将Akt调节的miRNA与胃癌发生发展这一病理过程联系起来。为进一步了解PI3K/Akt信号通路和miRNA在胃癌发生发展过程中的关系和功能机制奠定基础,促进胃癌早期诊断标志物和治疗靶标的研究开发。我们首先筛选了受Akt信号调节且有可能参与胃癌发生发展相关的miRNA。利用microRNA芯片,我们在腺胃上皮细胞特异性PTEN基因敲除小鼠的胃癌组织中筛选到了28个差异表达的miRNA。利用Northern Blot对其中10个miRNA进行检测,证明miRNA芯片结果是真实可靠的。接着,我们在胃癌细胞系BGC-823中抑制Akt信号通路,通过检测内源性miRNA的表达变化初步筛选到4个可能受Akt信号通路调节的候选miRNA。我们选取了对细胞增殖影响最为显著的miR-365进行进一步检测,以验证它的表达是否被Akt信号通路直接调节。用激活Akt信号通路的生长因子刺激可以显著抑制miR-365的表达,显示miR-365表达受Akt信号通路负调控。启动子报告基因实验结果显示该调节可能位于转录水平。miR-365的保守性和表达谱分析结果则提示miR-365可能在胃肠道组织的发育和病理过程中具有重要的功能。由于至今并未发现关于miR-365的任何细胞功能报道,我们首先在体外胃癌细胞中鉴定miR-365的功能。在多种胃癌细胞系中瞬时或稳定过表达miR-365并检测细胞增殖,结果表明miR-365能够显著抑制胃癌细胞增殖和克隆形成。反过来,在胃癌细胞中敲低内源性miR-365能够促进胃癌细胞增殖和克隆形成。进一步的细胞周期分析表明,miR-365过表达导致胃癌细胞G1期阻滞。软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验也表明miR-365抑制胃癌细胞的成瘤能力。上述结果提示miR-365可作为一个新的抑癌基因参与胃癌的发生发展。接下来,我们通过生物信息学分析鉴定了miR-365的两个靶分子,细胞周期调控分子cyclin D1和E2F2。通过检测内源性cyclin D1和E2F2的表达变化,表明miR-365可以负向调控这两个靶分子的表达。PTEN敲除小鼠的cyclin D1和E2F2表达上调同样证实了这点。3’UTR荧光素酶活性分析提示miR-365可能直接靶向周期调控分子cyclin D1和E2F2从而抑制二者的蛋白表达。最后,cyclin D1的过表达成功挽救了miR-365对细胞的增殖抑制效果,表明miR-365可能通过靶向cyclin D1抑制细胞增殖。最后,我们考察了miR-365是否可以介导Akt信号通路对胃癌细胞增殖的调节。miR-365的过表达明显逆转了Akt信号通路激活所导致的胃癌细胞增殖,反过来,敲低内源的miR-365缓解了Akt信号通路抑制导致的细胞增殖抑制。进一步的细胞周期分析也证实miR-365的过表达可有效抑制IGF-1刺激导致的S期细胞增多和G1期细胞减少。同样,cyclinD1和E2F2的表达变化与上述增殖与周期的检测结果一致。这些结果提示,miR-365可以作为Akt信号通路下游的效应分子,通过调节其靶分子cyclin D1和E2F2的表达,调控细胞周期和增殖。为了进一步在体内验证p-Akt-miR-365-cyclin D1/E2F2调控轴的作用,我们首先在PTEN和Akt1双基因敲除小鼠检测上述分子的变化,双基因敲除小鼠的miR-365表达上调以及靶基因cyclin D1和E2F2表达下调高度提示这一调控轴可能参与小鼠胃癌的发生发展。最后,我们在人的胃癌标本中进一步验证了p-Akt-miR-365-cyclin D1调控轴与胃癌的相关性。综上所述,本研究从胃上皮PTEN特异敲除小鼠胃癌组织中成功筛选到了受Akt信号通路调节的miR-365,并发现miR-365通过靶向cyclin D1和E2F2,诱导细胞G1期阻滞,抑制细胞增殖和肿瘤发生。而且,Akt信号通路可以通过下调miR-365的表达以及上调其靶基因cyclin D1和E2F2的表达促进胃癌细胞增殖。更重要的是,我们在小鼠胃癌模型和人胃癌组织中验证了Akt-miR-365-cyclin D1/E2F2这一调控轴参与胃癌发生发展。本研究首次报道Akt信号通路通过下调miR-365促进胃癌细胞增殖,在新的调控层次上丰富了对Akt信号通路调控机制的认识。