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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是目前危害最大的霉菌毒素,经细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶代谢活化后生成强毒性代谢物AFB1-8,9-环氧化物(AFBO),后者能共价结合DNA、蛋白质等生物大分子,造成DNA损伤、基因突变、细胞代谢障碍等,甚至细胞死亡。肝脏是产生CYP450酶的最主要器官,因此成为AFB1的靶器官。AFB1不仅威胁人类健康和生命,而且给养殖行业造成巨大经济损失。目前常用的AFB1减毒方法仍然存在作用效果弱、毒性大、对进入动物体内的AFB1无效等缺陷。阿魏酸(Ferulic acid,FA)是阿魏、当归、酸枣仁等多种中药材的重要有效成分。报道显示,FA具有抗氧化、抗凋亡、抑制CYP450酶等活性,能够在药物、高脂饮食等因素诱导的肝损伤中发挥肝细胞保护作用。然而FA在干预AFB1致肝损伤中的应用未见报道。本研究将以大鼠为实验动物建立AFB1诱导肝损伤模型并给予不同剂量FA进行干预,应用病理学技术和Western Blot、q PCR等分子生物学实验技术,通过检测血液生化指标、AFB1剧毒代谢物(AFB1-DNA和AFB1-ALB)的含量变化、肝脏组织病理学变化、肝细胞氧化应激相关指标,评价FA对AFB1诱导肝损伤的干预效果,通过测定关键CYP450酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1、CYP3A4)的表达变化以及线粒体途径凋亡通路中关键基因的表达变化,探究FA干预AFB1诱导大鼠肝细胞损伤的作用机制,最终阐明FA是否通过调控CYP450酶以及影响线粒体途径凋亡发挥干预AFB1致肝细胞损伤的作用。试验选取49只SPF级健康雄性Wistar大鼠,随机分成7组,每组7只,空白对照组(C组):每天灌服0.3 ml生理盐水;AFB1染毒组(AFB1组):每天灌服300μg/kg AFB1标准品;FA低剂量干预组(L组):每天灌服300μg/kg AFB1+60 mg/kg FA;FA中剂量干预组(M组):每天灌服300μg/kg AFB1+120 mg/kg FA;FA高剂量干预组(H组):每天灌服300μg/kg AFB1+240 mg/kg FA;阿魏酸对照组:每天灌服120 mg/kg FA;溶剂组(DMSO组):每天灌服0.3 m L DMSO。各组大鼠连续灌胃28 d后麻醉、称重、采血、安乐死,制备血清用于血液生化指标等实验,迅速摘下肝脏,一部分固定于福尔马林溶液中用于病理组织学检测,一部分冻存于液氮中用于后续实验。实验结果显示:(1)与C组相比,AFB1能显著降低大鼠体重(p<0.01),造成肝细胞凋亡和肝细胞坏死,导致血清ALT、AST、AKP、GGT、TBA指标明显升高(p<0.01);L组、M组、H组大鼠体重呈递增趋势(p<0.01),血清指标均显著降低(p<0.01),其中AST、AKP、GGT水平变化呈剂量依赖性;组织病理学检查结果,AFB1组大鼠肝细胞坏死、凋亡,肝细胞索结构紊乱,可见少量炎性细胞浸润,L组肝细胞颗粒变性,有炎性细胞浸润,M组和H组肝细胞结构完好,肝索清晰;与C组相比,FA对照组大鼠体重略有降低,但无统计学意义,肝细胞结构完整,染色均一,血清AKP显著降低(p<0.01),其他指标均无明显差异。(2)在对AFB1-DNA和AFB1-ALB加合物含量测定中,与AFB1组相比,L组、M组、H组均显著下降(p<0.05或p<0.01),且呈现剂量依赖性。(3)与C组相比,AFB1组大鼠肝细胞氧化应激标记物ROS和MDA含量显著升高(p<0.01),抗氧化酶SOD和GST活性降低,其中GST显著下降(p<0.01);与AFB1组相比,L组、M组、H组的ROS和MDA水平呈剂量依赖性降低(p<0.01),而M组、H组肝细胞SOD和GST活性呈上升趋势(p<0.01);与C组相比,FA组ROS和MDA均呈下降趋势,其中MDA呈极显著下降(p<0.01),FA组GST和SOD无明显变化。(4)线粒体途径凋亡相关基因表达水平检测结果显示,与C组相比,AFB1能显著上调促凋亡基因bax、caspase-3、caspase-9、cyt-c和p53(p<0.01),下调抗凋亡基因bcl-2(p<0.01);与AFB1组相比,FA干预组bax、caspase-3、caspase-9、cyt-c和p53相对表达量明显减少(p<0.01),bcl-2表达量显著增加(p<0.01);与C组相比,FA组的bcl-2基因显著上调(p<0.01),而其他凋亡相关基因无明显差异。(5)凋亡细胞染色结果显示,与对照组比较,AFB1组肝细胞凋亡数量显著增加(p<0.01);FA干预组凋亡细胞数量明显少于AFB1组。(6)与C组相比,AFB1能显著上调CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1、CYP3A4的表达(p<0.01);而与AFB1组相比,FA干预组CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1、CYP3A4的相对表达量显著减少(p<0.01);与C组相比,FA组CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1、CYP3A4等酶的表达无明显差异(p>0.05)。综上,本研究结果表明,FA一方面可以通过抑制CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1、CYP3A4的表达抑制AFB1剧毒代谢物AFBO的产生,减少AFB1诱导的肝细胞氧化损伤,另一方面可以通过抑制线粒体途径凋亡信号通路干预AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡,发挥干预AFB1致大鼠肝损伤的作用。