论文部分内容阅读
目前对发酵蔬菜及其腐败的研究主要集中在发酵过程的微生物区系变化和已腐败发酵蔬菜中微生物的分离鉴定,缺乏对发酵蔬菜在腐败过程中微生物动态变化及其规律的研究。已报道的发酵蔬菜腐败微生物主要为以酵母为主的真菌,因发酵池/坛密封不严氧气渗入而生长并造成腐败。鉴于此,本论文以植物乳杆菌菌剂发酵蔬菜为研究对象,模拟在发酵和储藏过程中有氧渗入发酵系统和无氧两种情况,监测腐败过程发酵体系中的微生物区系变化。利用选择培养基培养的方法对发酵蔬菜的腐败过程中不同种类的微生物进行计数,通过构建16S rDNA文库进行微生物区系分析。为了保证微生物区系分析的高保真性,本研究分别采用了5种方法来提取发酵蔬菜盐卤样品中微生物的基因组,并对提取得到的DNA纯度、浓度以及16S rDNA PCR扩增产物进行了评估。结果表明,成都福际生物公司的土壤DNA提取试剂盒所得的基因组DNA质量最高,并用于后续研究。在无氧发酵蔬菜体系中,在pH值由5.7±0.1下降至3.4±0.1的发酵阶段,乳酸菌(3.73×10~7 cfu/mL)为总细菌(4.68×10~7 cfu/mL)中的主要菌群。在贮藏过程中(pH值3.3～3.5),乳酸菌占到了总细菌数的53.7%。当进入到腐败阶段后,总细菌的数量迅速增加近4个数量级并伴随乳酸菌下降至无法检测,同时真菌开始复苏,腐败后期达到6.03×10~5 cfu/mL。在发酵过程中,Lactobacillus plantarum为最主要的乳酸菌,而在样品的储藏阶段,L.brevis数量逐渐增加,36天时L.brevis(4.57×10~4 cfu/mL)取代L.plantarum(7.76×10~3cfu/mL)成为了主要乳酸菌菌群。在未腐败样品的整个储藏阶段,L.brevis一直都是主要的乳酸菌菌种,并基本维持在10~4cfu/m L左右。而在腐败样品中,随着腐败的开始(pH值3.4±0.1～4.0±0.1),检测到的L.plantarum逐渐增多至2.00×10~5cfu/mL,重新成为优势乳酸菌;当pH值上升超过4.5时,L.plantarum的数量慢慢减少直至无法检测到,但其他腐败微生物如肠杆菌属(Enterobacter)、梭菌属(Clostridium)等迅速生长,在总细菌中所占比例分别超过了23%和18%。在有氧渗入发酵系统的条件下,菌剂发酵蔬菜在第8天是出现了盐卤表面形成膜醭的典型腐败现象。在前15天的发酵过程中,样品的pH值由5.5±0.2迅速下降并稳定在3.6±0.1。盐卤中的总细菌数在第8天为1.50×10~7cfu/mL(S8),第15天下降至7.00×10~5cfu/mL(S15)。之后随着pH值从4.5±0.3上升至6.3±0.3,细菌总数逐渐回升,从3.02×10~6 cfu/mL(S29)增加至4.61×10~8 cfu/mL(S57),并且膜醭中细菌总数的变化情况与盐卤中类似。然而,乳酸菌在盐卤及膜醭中所占比例的变化情况则有所不同。乳酸菌在盐卤中所占的初始比例为71.11%(S1),随着发酵、贮藏及腐败的进行,盐卤中乳酸菌所占的比例逐渐降低,从63.33%(S8)到无法检测(S57),从第15天开始,膜醭中乳酸菌所占比例就逐渐高于盐卤中的比例。在第29天和43天时,膜醭中乳酸菌所占比例61.29%(M29)和30.00%(M43)显著高于了盐卤中36.67%(S29)和1.7%(S43)。微生物区系在储藏及腐败过程中有较大差异。储藏及腐败前期盐卤及膜醭样品中以L.plantarum,Cit.freundii为主。腐败中期样品中的优势菌为Ec.Malodoratus和Prop.acidipropionici。从第22天开始,样品中出现了Leu.mesenteroides,而在36天样品中就没有检测到了。在腐败后期时,Providencia rettgeri、Morganella morganii、Shewanella algae、Corynebacterium nuruki开始出现,并逐渐开始成为优势菌群。比较发现,在无氧渗入及有氧渗入的两种条件下,菌剂发酵蔬菜均会发生不同程度的腐败现象。在腐败初期,出现L.plantarum生长,随着腐败的进行,L.plantarum减少,直至无法检测到,同时伴随着腐败菌群的生长。但是这两种条件下的腐败过程中微生物组成差异较大,有氧渗入的情况下细菌种类(23个种)远远高于无氧渗入时的细菌种类(9个种),并且在无氧渗入的样品中,细菌种类以梭菌属(Clostridium)的细菌为主。本论文结果为进一步解析菌剂发酵蔬菜的腐败规律和腐败防控措施的制定提供了理论基础。