论文部分内容阅读
研究背景:糖尿病状态下,高糖刺激使活性氧生成增多被认为是糖尿病心肌病发生和发展的重要原因。随着糖尿病病程的延长,心肌组织氧化应激损伤不断加剧,过多的活性氧刺激多种炎症因子表达升高,诱发炎症反应。长期炎症环境下可诱导组织及细胞损伤,诱导其死亡。细胞焦亡是一种新的促炎性细胞死亡方式,其特征为依赖于半胱天冬酶-1(Cysteine-containing aspartate specific protease1,Caspase-1),并伴有大量促炎症因子的释放。NLRP3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体作为炎症活化的一种方式,在疾病损伤中发挥着关键的作用,参与焦亡的发生。在细胞内,线粒体是氧自由基ROS(reactive oxygen species)产生的主要来源。而研究也证实NLRP3炎症小体激活所需的ROS信号来源于线粒体,线粒体来源的ROS在NLRP3炎症小体激活中发挥了关键作用。线粒体乙醛脱氢酶2(Aldehyde Dehydrogenase 2,ALDH2)是一个核编码的醛类氧化酶,定位于线粒体基质。研究发现,ALDH2在心肌缺血再灌注、酒精以及糖尿病等应激条件下对心肌具有保护作用。目前有文献报道,在糖尿病心肌缺血再灌注损伤过程中NLRP3炎症小体激活加重心肌损伤,沉默NLRP3基因可以改善2型糖尿病大鼠心肌损伤。但ALDH2与NLRP3炎症小体之间的联系如何,激活ALDH2在心肌细胞的表达是否抑制心肌细胞焦亡的发生,尚未见有报道。故本研究首先观察高糖诱导的心肌细胞损伤中是否存在细胞焦亡的发生,并构建ALDH2基因过表达稳定转染的心肌细胞株,以研究ALDH2高表达是否可减轻高糖引起的心肌细胞焦亡的发生。研究目的:观察高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤中是否存在细胞焦亡的发生,探讨高糖诱导的心肌细胞损伤中,线粒体ALDH2对细胞焦亡的关键因子的变化及可能的作用。研究方法:利用35mM的葡萄糖分别干预H9C2心肌细胞24h、36h、48h,应用Westernblot观察焦亡发生关键因子NLRP3、ASC、Caspase-1的变化。以最适感染复数感染H9C2心肌细胞,通过荧光显微镜检测感染效率,构建H9C2心肌细胞慢病毒阴性对照细胞株和ALDH2基因过表达细胞株,应用Real-time PCR和Western blot分别检测ALDH2 mRNA和蛋白表达。验证构建ALDH2基因过表达细胞株成功后,将细胞分为六组:正常对照组(normal control group,NG组,25mM葡萄糖)、慢病毒阴性对照组(negative control,GFP组)、ALDH2目的基因过表达组(ALDH2-GFP)、高糖损伤组(35mM葡萄糖)、高糖+GFP组、高糖+ALDH2-GFP组。高糖干预24h后,CCK8法检测不同组心肌细胞活性;Mitosox试剂测定线粒体氧化应激变化;ELISA法检测不同组细胞上清液中4-HNE、IL-18、IL-1β的水平;比色法检测不同组ALDH2活性;Western blot检测心肌细胞ALDH2、NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达水平。研究结果:(1)35mM的葡萄糖干预H9C2心肌细胞24h、36h、48h后,NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达在24h时较正常对照组明显升高(P<0.01),细胞焦亡发生达到顶峰,至48h逐渐下降;(2)Western blot及Real time PCR结果显示ALDH2过表达细胞株构建成功。与正常对照组相比,GFP阴性对照组中ALDH2蛋白水平及mRNA水平表达无明显变化,ALDH2-GFP组中ALDH2蛋白水平及mRNA水平明显升高(P<0.01);(3)CCK8细胞活力结果显示:与正常对照组相比,GFP组、ALDH2-GFP组中心肌细胞活力无明显变化,高糖损伤组、高糖+GFP组细胞活力降低;与高糖损伤组相比,高糖+ALDH2-GFP组细胞活力增高(P<0.01);(4)Mitosox试剂测定线粒体氧化应激损伤改变:与正常对照组相比,高糖损伤组、高糖+GFP组中红色荧光强度明显增强(P<0.01),提示线粒体氧化应激水平增高;与高糖损伤组、高糖+GFP组相比,高糖+ALDH2-GFP组红色荧光强度明显减弱(P<0.01),提示线粒体氧化应激水平降低;(5)ELISA结果显示:与正常对照组相比,高糖损伤组、高糖+GFP组中细胞上清液4-HNE、IL-18、IL-1β水平明显升高(P<0.01);与高糖损伤组相比,高糖+ALDH2-GFP组中4-HNE、IL-18、IL-1β水平明显下降(P<0.01);(6)比色法测定ALDH2活性结果显示:与正常对照组相比,高糖损伤组、高糖+GFP组中ALDH2活性明显下降(P<0.01),与高糖损伤组相比,高糖+ALDH2-GFP组中ALDH2活性升高(P<0.01);(7)Western blot结果显示:与正常组相比,高糖损伤组、高糖+GFP组中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白水平明显升高,与高糖损伤组相比,高糖+ALDH2-GFP组中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白水平明显下降(P<0.01)。研究结论:1、高糖诱导心肌细胞损伤,可引起NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡发生;2、ALDH2有可能通过减少线粒体ROS生成,进而抑制NLRP3炎症小体活化,减轻焦亡的发生,改善高糖诱导的心肌损伤。