【摘 要】
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多鳞白甲鱼（Onychostoma macrolepis）是秦巴山区山溪河流中重要的野生名贵经济鱼类,具有较高的营养价值和药用价值,但近年由于环境变化及人类活动的影响,其野生资源群体和个体数量急剧减少,现己被《国家重点保护野生动物名录》列为国家二级保护动物。鱼类非特异性免疫在抵御外源微生物中发挥重要作用,多鳞白甲鱼的非特异性免疫研究工作的开展,不仅有利于保护秦巴地区优势种的野生资源恢复,也可为其产
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多鳞白甲鱼（Onychostoma macrolepis）是秦巴山区山溪河流中重要的野生名贵经济鱼类,具有较高的营养价值和药用价值,但近年由于环境变化及人类活动的影响,其野生资源群体和个体数量急剧减少,现己被《国家重点保护野生动物名录》列为国家二级保护动物。鱼类非特异性免疫在抵御外源微生物中发挥重要作用,多鳞白甲鱼的非特异性免疫研究工作的开展,不仅有利于保护秦巴地区优势种的野生资源恢复,也可为其产业化的发展鉴定基础。养殖业发展中时有爆发细菌性疾病,研究先天免疫是有效防控鱼病发生的途径,先天性免疫应答被称为PRR的受体激活,该受体识别病原体中保守位于表面PAMP物质。C型凝集素是动物凝集素家族的重要成员之一,作为一种模式识别受体,能够识别外源微生物表面的特定碳水化合物,在天然免疫系统中发挥着重要的作用。为研究多鳞白甲鱼C型凝集素在抵御外源微生物方面的免疫功能,本研究基于多鳞白甲鱼肝脏和性腺转录组数据库,克隆得到2个C型凝集素基因,分别命名为OmCTL和OmLec1,并对其进行生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术分析两种C型凝集素基因在m RNA水平的组织表达模式,以及嗜水气单胞菌感染后在肝脏和脾脏组织中的表达分析;通过构建原核表达载体纯化出其重组蛋白,检测两种凝集素蛋白的凝集活性和免疫功能。得到以下研究结果:（1）OmCTL基因的CDS区全长共468 bp,开放阅读框编码共155个氨基酸;预测分子量为17.46 kDa,等电点为4.49;OmLec1基因的CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸;预测其相对分子量为21.99 kDa,理论等电点为8.79,两个基因均含有一个CRD和信号肽。对OmCTL和OmLec1基因的氨基酸序列进行同源性分析、多序列比对、系统发育分析,结果显示OmCTL基因与金线鲃相似度最高为76%,OmLec1基因与草鱼的相似度最高为71%,两个基因和鲤科鱼类进化成一支,发现两种基因的序列和结构特点均与C型凝集素相似,是C型凝集素家族的新成员。（2）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测OmCTL和OmLec1基因在多鳞白甲鱼肝脏、脾脏、肠、鳃、肌肉、性腺、肾脏、心、脑等组织中均有表达,其中OmCTL基因在性腺组织的表达水平最高,其次是肝脏和脾脏;而OmLec1基因在肝脏组织中表达量最高,其次是肠和脾脏。多鳞白甲鱼腹腔注射1.65*10~8 cell/m L的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）0.1m L后,OmCTL和OmLec1基因在鱼类主要免疫器官肝脏和脾脏中的表达水平均呈现先上调后下调趋势。OmCTL基因在肝脏组织中表达量24 h上调到最高值,是对照组的15.08倍（P<0.01）,在脾脏组织感染后12 h其表达量上调到最高值,是对照组的21.40倍（P<0.01）。OmLec1基因在肝脏组织中表达量于感染后3 h达到最高值（70.20倍,P<0.01）,而在脾脏组织表达量于处理6 h后达到最高值,表达量在24 h下降至正常水平。表明OmCTL和OmLec1在多鳞白甲鱼体内作为模式识别受体参与了抵抗病原微生物入侵的免疫应答过程。（3）构建的两个重组蛋白rOmCTL和rOmLec1都能识别、结合单糖、二糖、多糖等多个配体,通过ELISA证明rOmCTL和rOmLec1两个蛋白可以直接结合脂多糖、肽聚糖,并且结合能力随着蛋白浓度增加而增加;rOmCTL和rOmLec1在钙离子存在的条件下都显示出对大肠杆菌和嗜水气单胞菌的强凝集活性,但与rOmCTL相比,rOmLec1蛋白能凝集的细菌种类更多,效果更强。综上所述,多鳞白甲鱼C型凝集素OmCTL和OmLec1作为模式识别受体,表现出明显的细菌凝集活性和糖结合能力,在多鳞白甲鱼的免疫防御过程中发挥至关重要的作用,研究结果也为深入了解冷水性鱼类先天免疫防御机制提供了一定的理论支持。
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