高致病性PRRSV毒株的分离及PRRSV RT-LAMP检测方法的分析

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:ahua501
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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性病毒传染病,以仔猪呼吸障碍及妊娠母猪、公猪生殖障碍为主要特征,是严重危害全球养猪业的疾病之一。该病毒分为北美型和欧洲型两个血清型,我国流行的PRRSV毒株主要为北美型PRRSV毒株。本研究对吉林地区两个猪场的病猪进行了病料采集,在Marc-145细胞上进行了病毒的分离,经盲传后,病毒可在Marc-145细胞上产生明显的病变,经RT-PCR和免疫荧光鉴定,证明所分离到的病毒为PRRSV。将分离到的病毒分别命名为JILINTN1株和JILINTN2株。根据GenBank中PRRSV HUN4株的序列设计引物,通过RT-PCR成功扩增了PRRSVJILINTN1和JILINTN2株的ORF567和NSP2基因。并将其克隆到pMD18-T载体上,通过测序和生物信息学分析我们发现:针对GP5核苷酸序列的进化树显示JILINTN1和JILINTN2株与其他北美型PRRSV毒株处在同一分支上,这两个毒株的GP5,M和N基因与其他北美型的毒株同源性很高而与欧洲型毒株很低,说明这两个毒株属于北美型的毒株。对NSP2区域的比对结果显示,本研究分离到的两个毒株具有90个核苷酸的不连续缺失,为高致病性PRRSV。本研究建立了PRRSV的RT-LAMP诊断方法,基于序列的比对结果,设计了四条针对M基因的引物进行RT-LAMP试验。结果显示RT-LAMP的最佳反应条件为63℃反应40分钟。通过对RT-LAMP,RT-PCR和Real-time RT-PCR的敏感性进行比较,显示RT-LAMP的敏感性与Real-time RT-PCR相近,但是远远高于RT-PCR的敏感性。此外RT-LAMP检测方法被证明对临床样品有着很好的检测结果,可以用于现地检测,同时具有能够区分PRRSV和其他7种与PRRSV能引起相似症状的猪源病毒。
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