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实验背景和目的脉冲磁场作为非侵入性物理疗法治疗骨折延迟愈合在临床上已经取得了良好的效果,研究还表明脉冲磁场能够明显促进人脐静脉内皮细胞和牛主动脉内皮细胞的体外血管化。脉冲磁场发挥生物学作用有“窗口”效应,不同频率、时间和强度对细胞产生不同影响,尚无统一的参数标准。心肌微血管内皮细胞(CMECs)和心肌细胞(CMs)是心脏的主要组成成分,二者的功能受损与心脏病的发生发展密切相关,而内皮细胞的原始细胞即内皮祖细胞(EPCs)在治疗性血管新生,心脏和血管组织工程中有巨大的应用潜力。目前,有关脉冲磁场对上述3种细胞作用的研究尚少。本实验旨在研究固定频率和作用时间时,不同强度的低频脉冲磁场(LF-PMFs)对体外培养大鼠CMECs的增殖、凋亡、超微结构、迁移和成血管能力的影响;对乳鼠CMs的活力和凋亡的影响以及对二者共培养条件下CMECs增殖和成血管能力的影响;对体外培养大鼠骨髓源EPCs的增殖、细胞周期、凋亡、迁移和成血管能力的影响,以寻找该条件下磁场发挥作用的适宜强度,从而为LF-PMFs的深入研究和在临床及心脏组织工程等领域的扩展应用提供实验依据。试验方法第一部分: LF-PMFs对大鼠CMECs,CMs和CMEC-CM共培养的影响1.酶消化法结合差速贴壁法体外培养大鼠CMECs和CMs,电镜鉴定内皮细胞表型;2. CMECs和CMs完全随机分为四组:对照组,1.0mT, 1.4mT和1.8mT。除对照组外其余各组用频率为15Hz不同强度的的方波脉冲磁场刺激细胞,2h/d,持续刺激5d。对照组和曝磁后CMECs组:细胞计数法绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,透射电镜观察超微结构,划痕试验和Transwell小室法检测迁移能力,鬼笔环肽染色观察细胞骨架变化,管状结构形成试验和三维(3D)立体培养检测细胞成血管能力;对照组和曝磁后CMs组:MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测凋亡;3. CMEC-CM共培养:MTT法检测共培养和非共培养CMECs磁场内外增殖情况;4. CMEC-CM共培养3D管样结构形成试验和HE染色:试验分4组:CMs单独3D培养,CMECs单独3D培养,CMEC-CM3D共培养,1.4mT刺激下CMEC-CM3D共培养。第二部分:LF-PMFs对大鼠骨髓源EPCs的影响1.密度梯度离心法获得大鼠骨髓源EPCs,Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色鉴定EPCs表型;2. EPCs完全随机分为四组:对照组,1.0mT, 1.4mT和1.8mT。除对照组外其余各组用频率为15Hz不同强度的的方波脉冲磁场刺激细胞,2h/d,持续刺激5d。对照组和曝磁后EPCs组:MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,划痕试验检测细胞迁移能力,管状结构形成试验和3D培养检测细胞成血管能力。实验结果1.体外成功培养出含内皮细胞特有的超微结构Weible-Palade(WP)小体的CMECs。2. CMECs经1.4mT磁场干预后加速增殖,生长曲线峰值提前并提高,DNA合成活跃〔S期与对照组比较:(13.10±0.15)% vs (3.90±0.18)%,P<0.01〕,凋亡无明显改变,超微结构出现线粒体数量增多,内质网发达等细胞活性增强表现,细胞迁移能力显著增强,细胞迁移面积百分比达86.1%,细胞骨架结构发生重组,肌动蛋白染色清晰,应力纤维增多,并集中在细胞膜下,管样结构形成能力增强,3D培养时血管样结构密度增加,分枝增长。3. CMs经1.4mT和1.8mT磁场干预后细胞活力显著高于对照组(0.229±0.021 vs 0.196±0.012,0.252±0.012 vs 0.196±0.012,P<0.05),凋亡无明显改变。4.共培养时CMs能够促进CMECs增殖,1.4mTLF-PMF对共培养和非共培养的CMECs同样起着促进增殖作用。在3D培养研究中发现二者共培养时管样结构较各自单独培养时数量增多,密度增大,血管样结构的长度也明显增加,1.4mT磁场干预后更为显著。5.体外成功培养出EPCs,并经Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色鉴定证实。6. 1.0mT和1.4mT磁场促进EPCs增殖,细胞周期分布发生改变, DNA合成期和合成后期细胞比例增加,1.8mT磁场也能促进EPCs增殖,但对细胞周期分布影响不明显。流式凋亡检测发现磁场特别是1.0mT和1.4mT磁场刺激能诱导EPCs凋亡。体外培养EPCs迁移能力差,各强度磁场对其迁移能力也无明显影响。不同强度磁场均能够提高EPCs成血管能力,其中1.0mT和1.4mT作用明显,1.8mT磁场作用相对弱。结论脉冲磁场发挥生物学作用的“窗口”效应明显,不同强度磁场对体外培养细胞发挥作用不同。15Hz的低强度方波脉冲磁场(特别是1.4mT)对体外培养的CMECs发挥促增殖,迁移,提高细胞活性和成血管能力的积极生物学效应,同时提高CMs的活力,在CMECs和CMs共培养时同样发挥促CMECs增殖和血管化的作用,并且不影响二者的凋亡率。1.0mT和1.4mT磁场对EPCs产生双重作用,促进其增殖提高其成血管能力同时诱导细胞凋亡。磁场有促进血管新生的潜力,可能成为简单有效的促进缺血心肌血管生成或组织工程心肌血管化的新方法,但能否将脉冲磁场用于EPCs的体外扩增有待进一步论证。