荔枝AP2/EREBP转录因子的鉴定及其在体胚发生过程中的表达分析

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AP2/EREBP转录因子是植物最大的转录因子家族之一。前期研究表明,AP2/EREBP转录因子在植物体胚发生过程中具有一定的反馈调节作用,可以为突破优质作物育种瓶颈提供新的契机,然而AP2/EREBP转录因子家族在荔枝作物离体再生中的作用还未见报道。本研究对来源于荔枝基因组的AP2/EREBP基因家族进行了分析,研究了若干AP2/EREBP基因在荔枝体胚发生过程中的表达。主要结果如下:1、从荔枝基因组中获得202个荔枝AP2/EREBP转录因子。根据AP2/EREBP保守结构域数量、特征将其分为五大亚组:AP2亚组(19个成员),ERF亚组(105个成员),DREB亚组(70个成员),RAV亚组(6个成员),soloist亚组(2个成员);通过生物信息学分析,共鉴定出20个保守氨基酸基序;发现不同亚组基因结构不同;202基因不均等分布于15条染色体上。2、转录组数据表明,基因在特定组织或阶段中表达具有特异性。对202个基因在10个组织中的表达模式进行分析,发现AP2/EREBP基因在不同组织中表达模式具有相似性和差异性;同时对其在不同高频低频体胚发生荔枝品种‘新球蜜荔’和‘大丁香’中的表达模式进行了分析,发现同一体胚发生阶段不同荔枝品种之间某些基因的表达模式不同,并通过q-PCR验证了转录组数据的准确性。3、采用正交试验设计方法,初步建立了‘大丁香’荔枝品种的离体再生体系。胚性愈伤增殖的最佳配方为:M3、M4;体胚发生最佳配方为D11,体胚分化30d后,体胚分化率为998个/g FW,获得乳白色正常体胚;体胚成熟最佳配方为C;体胚再生培养基最佳配方为DR4,体胚萌发率为7.34%。并通过石蜡切片确定了‘大丁香’体胚发生过程的5个时间节点,分别为:0天:胚性愈伤组织阶段;5天:体胚开始发生阶段;10天:体胚发生阶段;15天:体胚大量发生阶段;20天:体胚发生结束阶段。4、根据转录组数据筛选出5个体胚关键候选基因,以体胚诱导过程中不同阶段的大丁香培养物为材料,对5个基因进行q RT-PCR分析,发现只有Litc.01B032540在体胚开始萌发阶段呈现较高的表达水平,克隆Litc.01B032540基因,c DNA全长839bp,通过blast比对,与前人研究的甜橙ERF114基因具有高度同源性,该基因在甜橙作物体胚中有一定的表达,推测荔枝Litc.01B032540在荔枝作物体胚发生过程中起重要调节作用。5、以pCAMBIA1301为基础载体,构建了Litc.01B032540基因超表达载体。在实验室已有‘妃子笑’荔枝品种遗传转化体系的研究基础上,优化了‘大丁香’荔枝品种的根癌农杆菌介导转化体系:即用GV3101菌株进行转化,菌液浓度OD600=0.60,侵染愈伤组织时长20min,共培养天数为3天,重悬液中添加的乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L,潮霉素浓度25μmol/L和特美汀浓度100μmol/L作为‘大丁香’抗性愈伤组织筛选剂配比。通过农杆菌转化,获得Litc.01B032540基因超表达阳性愈伤组织,通过GUS组织化学染色和PCR方法,获得阳性愈伤材料。由于新冠疫情的影响,进一步实验有延误,正在开展。
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