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钙调素(calmodulin,CaM)作为细胞内Ca2+受体,在钙信号转导中起着重要作用。不过,CaM本身不是结构蛋白,也不具备酶、转录因子或离子通道活性,必须通过钙调素结合蛋白(calmodulin-binding protein,CaMBP)来调节细胞生理。因此,研究CaMBP是解析CaM信号通路的重要途径。拟南芥IQM2由At3913600编码,是IQM家族的第二个成员,含有1个IQ基序,推测是一个Ca2+不依赖性的CaMBP。本文初步研究了IQM2基因的功能,所得主要结果如下:
1.AtlQM2基因的克隆。通过RACE和RT-PCR技术,获得AtlQM2全长cDNA,长度为2261bp,其中开放阅读框为1815bp,编码605个氨基酸。
2.生物信息学分析。IQM2蛋白不包含跨膜结构和信号肽序列,推断为非分泌性蛋白,预测还发现该蛋白定位于细胞核的可能性较大。蛋白功能结构域分析发现该蛋白含有1个IQ基序,蛋白的N端与豌豆重金属诱导蛋白6(HMIP6)有较高的同源性,而IQ基序分布在HMIP6结构域内部;C端与天花粉蛋白N端具有较高同源性。
3.双分子荧光互补实验。结果显示IQM2和CaM2在洋葱表皮细胞内能够结合,在激发光的作用下发出绿色荧光,证实IQM2蛋白在植物细胞内有CaM结合活性,是一个钙调素结合蛋白。
4.GFP亚细胞定位实验。IQM2-EGFP融合蛋白在洋葱表皮细胞的细胞核内,细胞膜上都有很强的荧光信号,证明IQM2蛋白定位在细胞核与细胞膜上,与生物信息学分析结果部分相同。
5.GUS表达分析。构建了IQM2启动子所驱动的GUS(PIQM2::GUS)表达载体,并转化野生型拟南芥植株,筛选纯合子,再对其幼苗进行GUS染色分析,结果显示,植株幼苗期IQM2基因主要在根部细胞中表达。
6.IQM2基因的RT-PCR分析。结果显示白光促进IQM2表达,渗透胁迫处理降低1QM2的表达水平,而短时间的脱水处理和重金属处理增强了IQM2的表达。
7.突变体鉴定。通过分子遗传学手段,鉴定了IQM2基因的T-DNA插入突变体iqm2-1,发现iqm2-1为T-DNA插入的iqm2 cryl双突变体。
综上所述,IQM2编码一个钙调素结合蛋白,定位在细胞核内,介导CaM、光和部分非生物胁迫信号的转导。