研究背景世界卫生组织报告指出,2015年全球有78.8万人死于肝癌,位居所有癌症病死率第二位。在我国,2015年新发肝癌病例数为46.6万例,占所有癌症发病率10.8%,因肝癌死亡人数为42.2万人,占所有癌症死亡率14.9%。目前医学界针对肝癌中最为常见的肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的主要治疗手段为外科切除、肝移植、放疗、化疗等,但上述治疗手段有着愈后较差、对机体损伤较大以及耐药现象等,使对肝癌的有效治疗进入瓶颈阶段。热休克蛋白90（Heat shock protein 90,Hsp90）是高度保守的一种分子伴侣,几乎在所有物种的细胞质都有大量表达,当机体处于应激状态时,其表达量将迅速上升。目前所发现Hsp90的200多种底物蛋白大多与细胞增殖、代谢等密切相关,表明Hsp90在肿瘤细胞的转归中发挥着关键的作用,另外,Hsp90在多种肿瘤细胞中均大量表达,且被证实与促进肿瘤细胞恶性进展有关,提示其有望成为癌症预防与治疗的关键靶点。近年来,针对Hsp90的抑制剂研发成为学术界的研究热点,按照其作用的位点不同主要分为3类:N端抑制剂、M端抑制剂、C端抑制剂。其中进入临床试验阶段的主要为N端抑制剂。以STA9090为代表的Hsp90 N端抑制剂与N端相应的底物蛋白竞争性争夺N端结合位点,使底物蛋白无法正常结合而被降解。而C端抑制剂新生霉素（Novobiocin,NB）则通过与Hsp90 C端结合,使其无法二聚化及发挥正常功能,因此NB不会引起细胞明显的热休克反应。由于HCC的发生发展与多种细胞信号转导通路有关,而参与这些通路的多种的信号转导分子大部分是Hsp90的底物蛋白,更重要的是,Hsp90在肝癌细胞中大量表达,提示Hsp90在维持肝癌细胞增殖,抵抗细胞凋亡中可能起着十分重要的作用。因此,以Hsp90作为靶点进行抑制干预,有可能进一步达到抑制肝癌的效果。电压依赖阴离子门控通道 1（Voltage dependent anion-selective channel 1,VDAC1）是位于线粒体外膜上的通道蛋白,其作用是构成线粒体通透性转换孔,控制物质进出线粒体,参与细胞的能量代谢、细胞损伤与修复、自噬、凋亡等细胞活动。在细胞应激状态下,由VDAC1寡聚化形成的大孔径膜通道可以使蛋白大分子进出线粒体,因此VDAC1的寡聚化被认为与线粒体介导的细胞凋亡有着十分密切的关系。细胞凋亡分为外凋亡与内凋亡,其中内凋亡又称线粒体介导的细胞凋亡。当线粒体接收到细胞内的凋亡启动信号后,位于线粒体外膜的VDAC1开始寡聚化,线粒体通透性转换孔打开,线粒体内的细胞色素C（Cytochrome C,cyto-c）释放到胞浆中,随即启动Caspase级联反应,细胞走向凋亡。有学者指出,NIMA相关蛋白激酶1（NIMA-related protein kinase 1,Nek1）能使VDAC1磷酸化,磷酸化后VDAC1无法形成寡聚体,参与线粒体相关的细胞凋亡进程,是影响VDAC1功能的重要蛋白。将VDAC1视为针对肿瘤治疗的靶点,利用VDAC1诱发肿瘤细胞启动凋亡具有一定程度的临床意义。综上所述,Hsp90与VDAC1均在肿瘤细胞中高度表达、均为高度保守的蛋白分子,是具有临床意义的肿瘤治疗潜在靶点。且有研究证明,两者之间存在一定的相互作用关系,因此,研究Hsp90与VDAC1之间的相互作用机制,以及两者对细胞凋亡通路的影响,有望为肿瘤药物研发提供理论依据。目的:1.使用不同浓度STA9090、NB处理人肝癌细胞株HepG2、Huh7,观察Hsp90对VDAC1蛋白表达量的影响。2.探究Hsp90不同结构域对VDAC1寡聚体形成的影响。3.研究Hsp90 N抑制剂、C端抑制剂对诱发HepG2细胞凋亡的效果。4.确定Hsp90与Nek1的相互作用关系。5.探索STA9090与干扰Nek1联合处理是否能诱发HepG2细胞凋亡。方法:1.用CCK8检测不同浓度的STA9090、NB处理两种HCC细胞系HepG2、Huh7细胞的细胞活力,得出两个细胞系对两种Hsp90抑制剂的IC50。2.用 western blot 检测 STA9090、NB 处理后的 HepG2 和 Huh7 细胞 VDAC1蛋白水平变化。3.利用原子粗颗粒化模型对Hsp90、VDAC1进行建模,并模拟两者在自然状态下的相互作用模式。4.用浓度分别为0.5mM、0.5μM的STA9090、NB处理HepG2和Huh7细胞,再运用化学交联剂EGS处理,用western blot检测各组间VDAC1寡聚体形成的差异。5.分离线粒体、胞浆蛋白,western blot检测线粒体蛋白cyto-c、COXIV、β-Actin的表达量6.用两种Hsp90抑制剂与凋亡诱导剂STS处理HepG2细胞,采用免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观测cyto-c与线粒体内参COXIV共定位情况变化。7.用 western blot 检测 STA9090、NB 处理后 PARP 的切割产物 cleaved-PARP的蛋白水平变化。8.用 0.2μM、0.5mM、0.5μM 的 STS、STA9090、NB 处理 HepG2 细胞,24h使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。9.用western blot检测STA9090、NB处理后Nek1的蛋白水平变化。10.应用免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观测用STA9090、NB以及凋亡诱导剂STS处理后HepG2细胞内Nek1的荧光强度大小。11.将Nek1的siRNA干扰片段转染到HepG2细胞中,用western blot检测干扰以及干扰联合STA9090处理下,PARP的切割产物cleaved-PARP的蛋白水平变化。结果:1.抑制Hsp90的N端和C端均能使VDAC1表达下降。2.Hsp90 C端与VDAC1寡聚体形成有关,而抑制Hsp90 N端则无法引起VDAC1寡聚化。3.Hsp90 C端抑制剂能诱发HepG2细胞凋亡,具体效应有细胞色素C释放、PARP被切割等,但N端抑制剂无法引起上述效应。4.Nek1蛋白在Hsp90 C端抑制剂处理后表达迅速下降,而N端抑制剂处理后Nek1无明显变化趋势。5.干扰Nek1可诱导HepG2细胞凋亡,而干扰Nek1联合Hsp90 N端抑制剂处理细胞后凋亡效应更明显。结论:1.抑制Hsp90影响VDAC1蛋白稳定性。2.Hsp90 C端抑制剂NB可诱导VDAC1寡聚化以及HepG2细胞凋亡,但N端抑制剂STA9090不能引起明显的细胞凋亡效应。3.干扰Nek1联合抑制Hsp90 N端可促进细胞凋亡。