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蜂王浆别名蜂乳、蜂皇浆。近些年有大量的研究报告表明,蜂王浆具有多种生物活性,如抗肿瘤、抗氧化、增强记忆力、调节免疫力、抗菌、修复组织损伤等。目前大部分学者主要研究蜂王浆的整体功效,而对于某些成分的具体功效报道较少。蛋白质是生物生长发育所需的必需营养素,蜂王浆蛋白是蜂王浆的主要成分,而蜂王浆的重要医疗保健作用和生物学功能,如抗肿瘤、抗氧化、抗菌等,与其中的蜂王浆蛋白密切相关。因此,本研究对不同条件提取出的蜂王浆蛋白进行研究并探究其体外消化产物的抗肿瘤作用,为蜂王浆蛋白在食品、医药领域的发展提供实验依据。1、采用六种方法(水提酸沉法、水提氨沉法、碱提酸沉法、碱提氨沉法、盐提酸沉法、盐提氨沉法)提取蜂王浆蛋白,通过SDS-PAGE凝胶电泳技术分别研究各实验组蛋白亚基组成,氨基酸分析仪测定各实验组蛋白氨基酸含量。SDS-PAGE电泳图显示水提酸沉法提取的蛋白质在52 kDa有三条清晰的条带,水提氨沉法提取的蛋白质在52kDa有两条清晰的条带。碱提酸沉和碱提氨沉所提取蛋白质在31 kDa、52-72 kDa、102-150kDa处有五条清晰的条带,两者亚基分布基本一致。盐提酸沉法,盐提氨沉法所提取的蛋白质分别在52kDa处有四条清晰的条带,两者亚基分布基本一致。六种方法提取的蛋白质中均含有52 kDa主蛋白,且水提酸沉法提取的主蛋白含量最高。氨基酸含量测定结果显示六种提取方法中,两种沉淀方法酸沉法和氨沉法相比,酸沉法的总氨基酸含量、必需氨基酸含量以及非必需氨基酸含量数值均要高于氨沉法;水提酸沉法提取的蛋白质氨基酸总含量和非必需氨基酸含量最高,盐提酸沉所提取的蛋白质必需氨基酸含量最高,碱提酸沉法提取的蛋白E/N,E/T值含量最高。六种方法提取的蛋白中含量较高的五种氨基酸依次为苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、门冬氨酸以及缬氨酸。由于碱提酸沉所提取的蜂王浆蛋白种类最为丰富,并且氨基酸含量适中,被筛选为实验用蛋白。2、通过单因素、响应面设计实验对蜂王浆碱溶性蛋白的提取工艺进行优化。在单因素实验基础之上,采用四因素三水平响应面实验确定蜂王浆蛋白最佳提取工艺。结果表明,当温度为38.59℃、料液比为1:8、pH值为10.15、超声时间为84.27 min时蜂王浆蛋白提取率最高为73.78%。利用LC-MS液相色谱质谱联用技术对其进行定性分析,得出该蜂王浆蛋白中共含有63种蛋白质并含有403种肽段。3、根据体外消化模拟实验制备蜂王浆蛋白体外消化模拟产物,水解产物水解度为28.80±1.42%;消化率为72.32±3.30%;利用SDS-PAGE凝胶电泳分析技术发现蜂王浆蛋白全部被水解成分子量≦10~15 kDa的小分子肽。通过倒置显微镜观察蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞SGC-7901的细胞形态的影响;MTT法检测蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞的增殖抑制率;集落形成实验测定其对胃癌细胞的集落形成能力抑制作用;流式细胞术检测蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞周期的影响;Western blot法探讨其影响机制,实验结果显示蜂王浆蛋白体外消化产物使胃癌细胞形态发生皱缩,细胞密度降低,降低其集落形成能力(P<0.05),对胃癌细胞SGC-7901的增殖具有抑制作用,在体外消化产物浓度为0.2 mg/mL时,24 h和48 h抑制率分别达到54.58±3.48%和62.84±1.98%(P<0.05)。与空白对照组相比,蜂王浆蛋白体外消化产物呈剂量依赖性抑制胃癌细胞SGC-7901细胞增殖,S期细胞减少,从而引起细胞凋亡。且经蜂王浆蛋白体外消化产物诱导后,胃癌细胞中p53表达增高(P<0.05),PARP-1蛋白表达降低(P<0.05)。4、利用蜂王浆蛋白体外消化模拟产物为主要原料,配以蔗糖、柠檬酸对蜂王浆蛋白口服液进行研制。通过三因素三水平的正交实验确定口服液最佳配制方法为:蜂王浆蛋白体外消化产物冻干粉30%、蔗糖8%、柠檬酸0.2%。经测定,该蜂王浆蛋白口服液感官、理化、微生物指标均符合国家标准。通过MTT法检测蜂王浆蛋白口服液对胃癌细胞SGC-7901的抑制率,发现其具有浓度、时间依赖趋势,48 h抑制率最高为17.97±2.31%。