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目的建立自身免疫甲状腺疾病(AITD)中Graves病(GD)和甲状腺相关性眼病(TAO)的动物模型,以IL-6/STAT1、STAT3为靶点研究木犀草素对小鼠自身免疫性甲状腺炎(EAT)的抗炎作用。方法第一部分：20只8周龄雌性BALB/c小鼠共分为3组,造模组(T289组)10只,对照组(pcDNA3.1组)5只和空白组(Control组)5只。使用过表达TSHR A亚单位的重组质粒pcDNA3.1-TSHR289对T289组和pcDNA3.1组小鼠进行基因免疫,免疫后立即给予电穿孔法进行体内转染,每3周1次,共免疫4次,末次免疫后第1周使用7.0T微型MRI仪检测免疫组和空白组小鼠眼球及眼外肌的变化,末次免疫后第2周处死小鼠。ELISA法检测小鼠血清总T4、TRAb抗体水平,甲状腺和眼部组织病理切片行HE染色、免疫组化和阿辛蓝染色。第二部分：将30只8周龄雌性C57BL/6小鼠分为4组,分别为造模组(TG组)10只、木犀草素(Luteolin组)组10只、地塞米松组(阳性对照组,DEX组)和空白组(Control组)各5只。将100μg的猪甲状腺球蛋白(pTG)(浓度1mg/ml)和100μl的弗氏完全佐剂完全乳化之后,给予TG组、Luteolin组和DEX组小鼠皮下注射(100μg/只)。第14天,再使用同样剂量的pTG和弗氏不完全佐剂乳化,给予以上组小鼠第二次皮下注射。从末次注射后第1天开始,每天分别给予木犀草素组和地塞米松组小鼠腹腔注射相应的药物,木犀草素剂量为10mg/kg/day,地塞米松剂量为5mg/kg/day,空白组给予PBS。用药7天后,在第21天处死小鼠。ELISA法检测小鼠血清总T4、TGAb抗体水平,甲状腺切片行HE染色。同时建立Raw264.7细胞炎症模型：将体外培养的Raw264.7细胞接种到6孔板, 加入IFN-γ(10ng/ml)培养过夜。第二天加入木犀草素(20μmol/l)处理6h。注意设置对照组及空白组。提取细胞内总蛋白,行western blot检测细胞内的STAT1、STAT3、环氧合酶2(COX2)的蛋白水平。结果第一部分：约80%的造模小鼠出现了甲状腺功能亢进的表现,包括甲状腺肿、病理学上甲状腺滤泡上皮细胞明显的肥大和增生及轻微的甲状腺炎、血清中T4水平和TRAb水平的显著上升。同时也观察到造模小鼠眼裂增宽(约30%)、MRI显示眼外肌体积增大、眼外肌中T淋巴细胞的浸润(约50%)及透明质酸的聚集(约30%),均符合人类Graves甲亢与眼病的表现,成功构建了GD与TAO的小鼠模型。第二部分：成功构建了EAT模型,40%左右的造模组小鼠均有甲状腺不同程度的肿大。50%左右造模组小鼠的甲状腺HE染色出现单核细胞的浸润,Luteolin组、DEX组(阳性对照)和Control组小鼠无单核细胞的浸润。甲状腺免疫组化结果显示木犀草素显著减少甲状腺内STAT1与STAT3的表达。Raw264.7巨噬细胞模型中,木犀草素明显抑制IFN-y诱导的细胞内COX2、磷酸化STAT3(Y705位点)和磷酸化STAT1(Y701位点)的升高,而总STAT3和STAT1保持不变。结论本实验成功构建了Graves甲亢和TAO小鼠模型,为Graves病发病机制与新型药物的研究提供了一个很好的工具。木犀草素抑制了EAT早期甲状腺内单核细胞的浸润,减轻甲状腺上皮细胞的破坏,为HT的早期干预药物的研究提供了新的思路。