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锑(Sb)作为一种自然界普遍存在的剧毒重金属,以微量的含量广泛分布于土壤,江河,大气等自然环境中,具有重要的工业用途。随着工业开采的日趋加剧,大量的矿产资源被开发利用,伴随而来的锑污染越发严重。作为剧毒污染物,微量锑中毒即会导致严重身体不适,甚至器官衰竭死亡。然而某些微生物可以在极高锑浓度下生长,在锑的地球生态循环中起着重要的作用。但目前关于Sb(Ⅲ)抗性菌和Sb(Ⅲ)氧化菌的发现鲜有报道,分子机制更是少有研究。为了揭开Sb(Ⅲ)抗性菌的神秘面纱,探究其抗性机理,本课题利用一株具有高Sb(Ⅲ)抗性和氧化表型的施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri TS44为实验材料,对其锑抗性相关基因进行分离鉴定和功能研究。本课题通过Tn5转座子插入突变方法,构建TS44突变体库,获得转化子3000个,经过反复筛选后获得3株锑抗性下降突变子,并成功分离出突变子的侧翼序列,依次为多聚磷酸盐外切酶基因(ppx)、细胞色素氧化酶亚基编码基因、孤儿组氨酸蛋白激酶(QseC/QseB)基因。由于之前已有相关文献猜测ppx基因可能参与铜离子的外排途径,因而本课题重点探究ppx基因对TS44锑抗性的潜在贡献作用。ppx基因编码多聚磷酸盐外切酶,可依次连续切断多聚磷酸盐最末端高能磷酸键,释放磷离子和大量能量。本实验通过基因敲除、互补以及荧光定量PCR等方法对ppx基因进行了深入探究,研究结果表明,TS44Δppx突变体的锑抗性明显下降,而互补菌株的锑抗性基本恢复,对数生长早期突变株体内锑浓度多于野生型3倍,荧光定量PCR结果显示ppx基因受锑诱导表达,且细菌体内多聚磷酸盐含量在加锑条件下降低。以上结果表明,ppx基因对Sb(Ⅲ)的外排具有重大贡献作用,其作用机理可能为：Sb(Ⅲ)通过甘油水孔蛋白等转运蛋白进入细胞质后,诱导ppx基因表达量上调且多聚磷酸盐外切酶酶活升高,从而水解多聚磷酸盐释放大量磷残基及能量供机体代谢,胞内大量磷残基与胞外氢离子形成跨膜质子梯度通道,Sb(Ⅲ)被磷残基携带而运出体外,最终减少了Sb(Ⅲ)对菌体的毒害作用。此外,为了更加深入了解Sb(Ⅲ)的外排途径,本研究曾对部分表达上调幅度较大的耐药小节细胞分裂家族(RND)外排基因进行功能缺失突变,发现突变株的锑抗性表型没有明显变化,说明Sb(Ⅲ)的外排过程并未受到明显抑制,猜测Sb(Ⅲ)的外排过程是由多基因共同协调表达完成的复杂代谢过程,因而需进一步分析验证。本研究对菌株TS44的锑抗性机理进行了简要阐述,并首次证实了ppx基因对Sb(Ⅲ)抗性具有重大影响,对后续微生物的锑代谢机理研究具有重要借鉴价值。