纺织用碱性耐热过氧化氢酶的微生物法生产及保存稳定性的研究

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过氧化氢酶,简称CAT,存在于所有好氧微生物和动、植物细胞内。其生理功能为作为特殊的过氧化物酶调节机体内H2O2的水平。各种来源的过氧化氢酶有着广泛的用途,如用于临床诊断和食品消毒中残余H2O2的分解等。最近,过氧化氢酶开始用于织物漂白工艺中替代水洗和化学试剂还原法去除H2O2。同从动植物组织中提取相比,微生物法合成过氧化氢酶具有许多优点。本论文以一株嗜热子囊菌Thermoascus aurantiacus WSH 03-01为出发菌株,首先考察了诱导剂对过氧化氢酶合成的影响,并研究了接种量和搅拌转速对7 L罐中过氧化氢酶分批发酵的影响,确定了合适的接种量和搅拌转速;通过测定发酵过程中乙醇的消耗曲线确定了影响过氧化氢酶合成的关键因素,在发酵过程中流加乙醇实现了过氧化氢酶的高产,并将7 L罐实验结果放大到30 L的规模;此外还研究了稳定剂对Thermoascus aurantiacusWSH 03-01所产过氧化氢酶粗酶保存效果的影响,并考察了该酶去除H2O2的效果。主要研究内容如下:(1)在发酵0 h添加88 mmol/L的H2O2,发酵终了过氧化氢酶酶活比对照提高了26.0%。如果在发酵的24 h或48 h分别添加1μmol/L的甲萘醌,发酵终了过氧化氢酶酶活比对照分别提高了11.0%和23.1%;而若在发酵的36 h和48 h各添加1μmol/L的甲萘醌,过氧化氢酶酶活可提高32.5%。在发酵0 h添加88 mmol/L的H2O2,同时在48 h添加1μmol/L的甲萘醌,过氧化氢酶酶活达到1725 U/mL,比对照(1074 U/mL)提高了60.6%。表明T.aurantiacus WSH 03-01合成过氧化氢酶是可以被诱导的。(2)在7 L罐中考察了接种量和搅拌转速对过氧化氢酶分批发酵的影响,确定了合适的接种量为7%,最佳搅拌转速为200 rpm,过低或过高的搅拌转速均不利于过氧化氢酶的合成。在该条件下发酵96 h过氧化氢酶酶活最高为1851 U/mL。(3)通过测定发酵过程中乙醇的消耗曲线确定了乙醇的流加速率为0.14 mL/h·L,在发酵过程中流加乙醇实现了过氧化氢酶的高产,发酵终了过氧化氢酶酶活为2453 U/mL。将7 L小罐实验结果放大到30 L的规模,发酵118 h时酶活达到最大值2287 U/mL。采用两阶段控制搅拌转速的方式较好地解决了后期溶氧偏低的问题,115 h细胞干重达到最大值9.56 g/L,发酵120 h酶活最高达到3652 U/mL。(4)向发酵超滤液中加入稳定剂氯化钠20 mmol/L或甘油90g/L或明胶0.5g/L,在40℃保存60 d其酶活保留率均在90%以上。(5) T. aurantiacus WSH03-01合成的过氧化氢酶在pH5.5-8.0,温度15℃-40℃时对H2O2都有很好的去除效果,15 min后100 ppmH2O2都能全部去除。
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