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目的:1.敲减大肠癌耐药细胞中的Flotillins蛋白,观察下调Flotillins对大肠癌细胞耐药性的影响,明确下调Flotillins蛋白的表达是否具有逆转大肠癌细胞耐药性的作用。2.观察大肠癌耐药细胞敲减Flotillins蛋白后,FAK（Focal adhesion kinase,黏着斑激酶）活性及表达量的变化,明确敲减Flotillins是否具有下调FAK的作用,探讨Flotillins、FAK与大肠癌细胞耐药性的关系。3.激活敲减Flotillins蛋白的大肠癌耐药细胞中的FAK,观察FAK的激活是否可以拮抗Flotillins下调所致耐药性逆转的作用,探讨FAK活性的下调在敲减Flotillins逆转大肠癌肿瘤耐药性中的作用,明确FAK是否是介导敲减Flotillins逆转大肠癌耐药细胞耐药性的关键分子。方法:1.复苏实验室已获得大肠癌细胞HCT-15的耐药细胞株,慢病毒转染Flotillin1、Flotillin2的Flotillins蛋白敲减株。根据细胞耐药性及敲减Flotillins蛋白的状态,将细胞分组并分别命名为:亲本细胞HCT-15/ADM-,耐药细胞HCT-15/ADM+,敲减Flotillin1的细胞HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,敲减Flotillin2的细胞HCT-15/ADM++Flot2-RNAi以及转染空载的细胞HCT-15/ADM++Con。大剂量ADM（阿霉素）同步间断冲击HCT-15/ADM+、HCT-15/ADM++Con、HCT-15/ADM++Flot1-RNAi、HCT-15/ADM++Flot2-RNAi并与亲本细胞HCT-15/ADM-对照,计算耐药细胞耐药性,以中度耐药性（RI（Resistance Index,耐药指数）>5）作为细胞耐药标准。2.Western Blot检测以上各组细胞Flotillins蛋白表达,比较HCT-15/ADM-与HCT-15/ADM+中Flotillin1和Flotillin2的表达,研究Flotillin1、Flotillin2与肠癌细胞耐药性的关系;比较HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi与HCT-15/ADM++Con中Flotillin1和Flotillin2的表达,评估Flotillin1、Flotillin2的敲减效果。3.分别比较HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi及HCT-15/ADM++Con的耐药性,检测两组细胞在不同浓度ADM作用下的增殖抑制率,计算耐药指数RI,比较两组细胞的耐药性变化,观察敲减Flotillins蛋白后大肠癌耐药细胞耐药性的变化,探讨敲减Flotillins逆转大肠癌耐药细胞耐药性的作用。4.Western Blot检测HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi与HCT-15/ADM++Con中总FAK与p-FAK的表达量,比较两组细胞中总FAK与p-FAK表达量的变化,探讨Flotillins蛋白、FAK与大肠癌细胞耐药性的关系。5.FAK激活剂激活HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi与HCT-15/ADM++Con中FAK,Western Blot检测p-FAK的表达,比较两组细胞中FAK活性恢复情况;检测并比较活化FAK后,Flotillins蛋白敲减株的耐药性变化,观察FAK活化对大肠癌耐药细胞耐药性的作用,明确FAK在敲减Flotillins逆转大肠癌耐药细胞耐药性中的意义。6.对比观察HCT-15/ADM++Flot1-RNAi、HCT-15/ADM++Flot2-RNAi细胞株中Flotillin1和Flotillin2的表达,探讨Flotillin1、Flotillin2相互作用关系。结果:1.HCT-15/ADM+及HCT-15/ADM-对ADM的半数抑制浓度Ic50分别为6.488±0.637ug/m L和1.225±0.137ug/m L,耐药指数RI达到5.296,符合中度耐药。2.Flotillin1和Flotillin2在HCT-15/ADM+中的表达量与HCT-15/ADM-相比,均明显升高。3.HCT-15/ADM++Flot1-RNAi细胞中Flotillin1的表达量与HCT-15/ADM++Con相比,其敲减效率达82.9%;HCT-15/ADM++Flot2-RNAi细胞中Flotillin2的表达量与HCT-15/ADM++Con相比,其敲减效率达78.4%。4.HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi细胞对ADM的半数抑制浓度Ic50分别为4.522±0.092ug/m L和3.298±0.318ug/m L,与HCT-15/ADM++Con细胞（7.723±0.801ug/m L）相比,其耐药逆转倍数分别达1.7079和2.3417。5.HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi中p-FAK（Tyr397）的表达量与HCT-15/ADM++Con相比下调率达88.3%和52.5%,表明Flotillins的敲减与p-FAK的变化存在相同的下调趋势。6.使用FAK激活剂后,HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi中p-FAK的表达量与未使用激活剂相比,其FAK激活效率分别达219.74%和137.46%;与HCT-15/ADM++Con相比,其FAK激活效率分别达29.48%和69.75%。7.激活HCT-15/ADM++Flot1-RNAi,HCT-15/ADM++Flot2-RNAi中FAK后,前者对ADM的半数抑制浓度Ic50升至7.488±0.4321ug/m L,耐药恢复倍数达0.704;后者对ADM的半数抑制浓度Ic50升至11.827±0.2125ug/m L,耐药恢复倍数达1.112,表明FAK的活化可以部分或完全抵消敲减Flotillins所致的耐药性下调。8.敲减Flotillin2后,引起Flotillin1的下调,下调率达84.73%,差异具有统计学意义;敲减Flotillin1后,对Flotillin2的表达几乎没有影响。结论:1.大肠癌耐药细胞中Flotillin1、Flotillin2的表达均上调。敲减Flotillin1和Flotillin2后大肠癌耐药细胞的耐药性得以逆转,提示Flotillin1和Flotillin2均参与大肠癌肿瘤耐药性的形成,并可作为治疗大肠癌患者化疗耐药的备选靶标。2.敲减Flotillins蛋白逆转大肠癌耐药细胞耐药性的同时,FAK活性表达下调,激活FAK后,耐药细胞对化疗药物的敏感性降低,说明FAK参与介导大肠癌细胞耐药性的形成,FAK活性的下调是敲减Flotillins逆转大肠癌耐药细胞耐药性的重要分子机制。3.与敲减Flotillin1相比,敲减Flotillin2后,大肠癌耐药细胞耐药性逆转的更加明显,其机制可能是敲减Flotillin2引起Flotillin1的下调所致。4.在逆转大肠癌耐药细胞耐药性过程中,Flotillins的下调主要通过调控FAK的活性发挥作用,且与下调Flotillin2相比,下调Flotillin1对FAK活性的调控作用更加明显。