随着社会的快速发展、人类生活水平提高的同时,其健康问题也日益凸显。其中,恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的主要疾病之一,据2019年全国癌症研究报告显示,其死亡人数高达23.91%,且发病率逐年上升。因此,癌症等重大疾病的精准诊断与高效治疗极为迫切。发展能特异性识别疾病标志物的生物探针及扩充候选药物分子,对于疾病诊疗研究非常重要,而探针与药物分子的制备基础是基于分子识别及其相互作用。功能核酸是一类具有分子识别或者类酶催化活性的寡聚核苷酸分子,具有设计灵活可控、靶标范围广、快速合成和易于化学修饰等优点。功能核酸大致可以归为三类。一是指具有分子识别和类酶催化活性能力的DNA分子片段,称之为脱氧核酶（DNAzyme）;第二类是指拥有跟抗体一样的识别能力,但靶标分子范围更广的寡聚核苷酸片段,称之为核酸适体（Aptamer）;第三类是具有茎-环结构的单链寡核苷酸探针,称之为分子信标（Molecular beacon）。自20世纪90年代首次提出以来,由于优异的分子识别功能,功能核酸在疾病诊疗体系中备受关注,对疾病从分子水平上进行精准诊断与高效治疗提供了新工具。传统功能核酸为分子工具应用于疾病相关诊断与治疗时,往往会受到其中相应生理环境的限制。比如由于生理环境中金属离子、蛋白质分子等物质的干扰,功能核酸对一些疾病生物标志物分子的识别能力和检测灵敏度都受到很大限制,还有一些功能核酸药物分子在细胞内的释放效率较低等等。为了解决以上这些问题,本论文从如下几个方面开展研究:（1）基于T细胞肿瘤免疫治疗时,肿瘤组织中部分癌细胞坏死导致释放高浓度的钾离子,严重破坏周围浸润T细胞的代谢,降低其活性,引起离子免疫抑制,降低抗肿瘤活性。为了对离子免疫抑制现象进行研究,相应生理环境中的钾离子精准检测具有重要意义。G-四链体功能核酸被广泛用作钾离子识别单元,但传统G-四链体功能核酸在生理浓度钠离子（～150 m M）条件下很难专一性识别钾离子。本文第二章提出以G-四链体分子间构象改变识别K+,替代传统的G-四链体分子内构象改变同时识别K+和Na+。通过将传统的G-四链体结构截断为两个部分,在半长的富G-四链体序列中,成功地筛选到了在生理环境中可以选择性识别钾离子的核酸序列oligo-3（5′-TGAGGGAGGGG-3′）。在150 m M Na+存在下,oligo-3对K+（5.0 m M）的选择性相关系数?=232,为在生理Na+浓度存在下,选择性检测K+奠定了基础。（2）当G-四链体功能核酸荧光检测生理环境中K+离子,还存在功能核酸易受环境中核酸酶降解和生物自发背景荧光高两项挑战。第三章在以筛选到得到在生理条件下对钾离子特异性识别的半长G-四链体功能核酸作为识别单元的基础上,在核酸3?-端修饰反转T碱基修饰,成功进行了抗核酸酶切割保护。另外,以嵌入G-四链体结构的双光子染料EBMVC-B进行信号输出,显著降低了生物复杂体系中背景荧光信号的干扰。最后因G-四链体整体结构被拆分,oligo-3对K+的结合难度增加,使对K+的线性响应范围为100?M-10 m M,血液模拟肿瘤微环境,在生理环境中对钾离子成功地进行了检测。（3）阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease,AD）是一种神经退行性疾病,其血液中的疾病标物浓度低、单一指标检测易造成假阳性信号。针对这两项挑战,在第四章中,通过基于二级结构编码的DNA三链分子开关（triple-helix molecular switch,TMS）耦合α-溶血素纳米孔技术,成功实现了电化学同步分析阿尔兹海默症疾病多重疾病标志物。将TMS环部的核酸适体序列作为识别单元,分别识别三种AD标志物,茎部三链部分作为信号传导链。由于三链中间链分别设计成单链、单链尾端折叠成双链和单链尾端折叠成G-四链体三种DNA链,三者的空间尺度不同,通过纳米孔的时间会存在明显差异,产生不同时间上的电流阻断,输出三种差异性的电化学信号,实现了在血液中高灵敏、多参数地同步分析阿尔兹海默症疾病标志物。（4）前列腺癌在血液中的标志物前列腺癌特异性抗原（PSA）的丰度极低。为了检测这一癌症标志物,本文第五章成功构建了以DNA三链分子开关（TMS）为分子识别单元,血液中内源性的人血清白蛋白（HSA）作为级联信号放大器,实现了血液中PSA的高灵敏检测。其基本原理是TMS的环部是一段可以特异性识别PSA的核酸适体序列,茎部中心链尾端标记巯基官能团,并采用一种可以插入DNA分子双链或三链的小分子荧光染料EBCB作为信号输出。研究发现EBCB可以特异性的绑定HSA,极大的增强其荧光量子产率。当通过Au-S键把三链分子信标开关绑定在金纳米颗粒表面上,金纳米颗粒会淬灭染料EBCB的荧光,当PSA存在的时候会绑定分子信标环部,引起构象变化使得三链打开,释放染料,恢复荧光,同时游离出来的EBCB会立马嵌入血清中的HSA结构内部,进行级联信号放大,成功实现了血清中PSA的高灵敏检测。（5）功能核酸药物CpG DNA在细胞内涵体中与蛋白质TLR9受体绑定后,还需与细胞质中下游一系列信号分子My D88等依次结合才能激活整个信号通路。因此,在细胞内游离的CpG DNA可以更好的发挥药物活性。在第六章工作中,我们用氧化铈纳米颗粒对CpG DNA进行负载,使其跨过细胞膜后,可以被细胞内的H2O2取代游离出来,与传统共价交联在纳米颗粒表面的相比,游离出来的CpG DNA与蛋白质TLR9受体结合后可以更灵活地激活下游信号通路,从而可以更好的刺激抗原提呈细胞（APC）成熟以及后续的免疫响应;同时,通过与光动力学的联合治疗,可以原位生成肿瘤疫苗,促进免疫反应,攻击光动力学治疗后的残余肿瘤组织,从而避免肿瘤组织的复发。本文工作围绕功能核酸作为分子识别工具,通过对其进行修饰与改造,使其应用于生理环境,有效提高对疾病诊断的准确性与灵敏度,以及进一步用于提升疾病治疗的效率;所设计和构建相关功能核酸探针策略对于生理环境中的生物标志物精准分析具有一定通用性与潜在的应用前景。