肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）是一种支配随意运动的上下运动神经元选择性受累的神经系统变性疾病。它是以进行性的肌肉无力为特点的致死性疾病，患者多在首次出现症状后的3-5年内死于呼吸衰竭。该病的平均发病年龄在59岁，发病率在1/10万-3/10万，患病率多在5/10万-7/10万，是成年人最常见的导致瘫痪的疾病之一。根据其特点本病又可分为家族型肌萎缩侧索硬化（Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis，FALS）和散发型肌萎缩侧索硬化（Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis，SALS），其中FALS 不足10%，而SALS则占整体ALS的90%以上。ALS的典型病理改变为皮层上运动神经元和脑干、脊髓的下运动神经元丧失，锥体束变性，以脊髓的改变最为明显，残留的运动神经元通常也发生萎缩，在胞体和轴突中有神经丝的异常聚集。时至今日，治疗上除仅有的几种（如机械通气、力如太）能在一定程度上延长ALS的病程外，尚无特效的治疗手段，这主要是由于人们对此病运动神经元损伤的原因、机制及转归等了解不清所致。实验模型的建立将有助于人们进一步探讨其发病机制，开发新型神经保护治疗。病因学研究发现10-20%的FALS（约占总的ALS患者的5-10%）有铜/锌超氧化物歧化酶的基因突变，提示FALS可能就是一种基因病，而占ALS绝大多数的SALS病人的病因目前仍不清楚。一些研究显示SALS的发病机理可能集中在以下几个方面：兴奋毒作用、自身免疫异常、氧化应激、神经元调亡及线粒体功能障碍等。其中以兴奋毒机制证据最多。谷氨酸是中枢神经系统内最主要的兴奋性递质，谷氨酸能神经元过度激活及突触间隙中的谷氨酸过多堆积均可通过激活谷氨酸受体对突触后神经元及其周围组织造成兴奋毒性。在胶质细胞和神经元胞体中均存在有谷氨酸转运体，尤其是星形胶质细胞上的高黏附性的谷氨酸转运体，可以转运细胞外的谷氨酸，这是机体避免兴奋毒的主要机制。当谷氨酸转运体功能受到明显抑制时，就会造成细胞外谷氨酸堆积形成兴奋毒性。脊髓的器官型培养可以长时间地进行培养并可维持相对完整的脊髓<WP=5>形态，较单细胞培养更适于研究脊髓病变。我们利用脊髓器官型培养技术，结合谷氨酸兴奋毒机制，慢性阻抑培养脊髓片的谷氨酸转运，可以制备ALS的体外培养模型，进一步探讨选择性运动神经元损伤的部分机制。课题研究分三部分：第一部分建立脊髓片器官型培养方法，并将培养的脊髓片与体内发育至同时期的脊髓做比较；第二部分依据谷氨酸兴奋毒机制，应用适当浓度的谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸抑制谷氨酸转运，使细胞外谷氨酸堆积对运动神经元造成损伤而感觉神经元不受影响，建立ALS的体外培养模型。第三部分利用体外培养模型观察ALS患者血清对脊髓运动神经元的影响，探讨其选择性运动神经元损伤的部分机制。一、脊髓薄片器官型培养的方法研究目的: 研究脊髓薄片器官型培养的方法并对脊髓腹角α运动神经元和背角中间神经元进行鉴别，建立稳定的脊髓体外培养模型。观察体外大鼠器官型培养的脊髓薄片是否与同龄大鼠体内生长的脊髓具有相似的形态和恒定的腹角α运动神经元数目，建立能模拟体内生长环境的稳定的体外脊髓器官型培养模型。方法：脊髓器官型培养采用8日龄SD大鼠的腰段脊髓，在无菌条件下快速分离、取出整条脊髓，解剖显微镜下分离并剪断腰段脊髓的神经根，用MCIL组织切片机切成350μm厚的薄片，将腰段脊髓的切片转移到GBSS中，在室温下仔细分离成单片，6孔培养板内每孔放入1ml培养基MS，并放置Millipore insert.，将完好的脊髓片转移至insert上，每个insert上放5片，入CO2培养箱（37℃，5% CO2+95%空气），每周换液2次。测定各时点培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的含量。用神经元的特异性免疫组化染色SMI-32对脊髓腹角α运动神经元加以鉴定并与同龄大鼠体内生长的脊髓做比较，用抗Calretinin单克隆抗体对脊髓片背角的中间神经元进行鉴别。结果：脊髓片在体外生长良好，形态完整，培养存活率高，达90%以上；存活时间长，可达2个月以上。SMI-32组化染色可见每侧的脊髓腹角均有 5-15个左右的α运动神经元被染成深棕色，其直径均在25μm以上，突起细长，彼此形成突触联系，α运动神经元数目与体内发育至同时期的大鼠比较无显著差异。Calretinin组化染色见双侧脊髓背角有大量Calretinin阳性着色的中、小体积的中间神经元，而脊髓腹角α运动神经<WP=6>元多为阴性。脊髓培养液中LDH的含量较恒定，各时点差异无显著性。结论：本实验研究成功地建立了大鼠腰段脊髓的器官型培养模型，并能以免疫组化方法对腹角α运动神经元和背角感觉神经元进行鉴别。培养的脊髓片存活率高，存活时间长，可维持恒定的α运动神经元数目，与发育至同时期的大鼠体内脊髓切片比较形态、α运动神经元数目均无显著差别，在一定时期内可以模仿体内的生存环境，为研究脊髓生理、病理改变及开发新的神经保护因素提供了有效的实验方法。二、肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的研究目的：越来越多的研究显示谷氨酸的兴奋毒性作用是ALS发病的重要机制之一。人体内最主要的也是含量最高的兴奋性氨基酸是谷氨酸，正常情?