黄酒酵母2-苯乙醇合成途径中预苯酸脱水酶的催化特性研究

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2-苯乙醇(2-Phenylethanol;2-PE)是一种具有玫瑰香味的芳香醇,是黄酒中重要的香气物质之一。黄酒中的2-苯乙醇主要是在黄酒酿造过程中由黄酒酵母来合成。提高黄酒酿造过程中酵母生成2-苯乙醇的能力,不仅有利于提升黄酒的风味品质,其较高的香气强度也可以赋予黄酒独特的风味,但不同批次黄酒基酒中含量参差不齐,是黄酒品质不稳定的一个重要因素。本研究在前期工作中从黄酒发酵醪液中筛选得到一株高产2-苯乙醇的黄酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,HJ),通过序列比对明确黄酒酵母HJ中2-苯乙醇合成代谢途径中的合成关键酶,为黄酒中2-苯乙醇含量的理性控制提供了操作靶点。本研究主要研究结果如下:分别采用酿酒酵母模式菌株W303和黄酒酵母HJ制作酒母,用于黄酒发酵,检测发现黄酒酵母HJ生成2-苯乙醇的含量比酵母模式菌株W303升高了约50%。然后分别对酿酒酵母模式菌株W303和黄酒酵母HJ中预苯酸脱水酶(PHA2p)的序列进行扩增测序比对,结果发现:与酿酒酵母模式菌株PHA2pW303相比,黄酒酵母PHA2p HJ序列发生了三处自然突变(I161K、L239P、Q250H)。对酿酒酵母模式菌株W303和黄酒酵母菌株HJ中PHA2p蛋白的分别进行原核表达、纯化。最后分别对纯化后PHA2p此酶蛋白的稳定性、苯乙醇耐受性、末端代谢产物反馈抑制的能力等进行测定。结果表明:该酶的最适作用pH为8.2,最适反应温度为45℃;在pH在6.28.7范围内较稳定,酶活在4060℃范围内保持较好;酪氨酸(Tyr)及色氨酸(Try)对该酶活性影响较小,其中Tyr对预苯酸脱水酶具有极小的促进作用。对纯化后的酿酒酵母模式菌株W303及黄酒酵母菌株HJ中的预苯酸脱水酶进行酶动力学的研究:酿酒酵母模式菌株W303和黄酒酵母HJ中的预苯酸脱水酶Km=0.16mmol?L-1,酿酒酵母模式菌株W303中kcat/Km催化效率指数=26.50 L?mmol-1?min-1,黄酒酵母HJ中为36.48 L?mmol-1?min-1;外源添加3 mmol·L-1苯丙氨酸(L-Phe)的情况下,模式菌株W303中的预苯酸脱水酶Km=0.27 mmol?L-1,kcat/Km催化效率=2.82L?mmol-1?min-1;黄酒酵母中黄酒酵母菌株HJ的预苯酸脱水酶Km=0.27 mmol?L-1,kcat/Km催化效率=2.91 L?mmol-1?min-1。根据上述动力学数据,研究发现来自酿酒酵母模式菌株W303和黄酒酵母HJ pha2基因编码的预苯酸脱水酶均受到L-Phe的反馈抑制,同时也发现黄酒酵母菌株HJ的预苯酸脱水酶的比酶活比酿酒酵母模式菌株W303提高了22.60%。这为酿酒酵母芳香族氨基酸代谢途径的改造提供了新的靶点。将黄酒酵母HJ与酿酒酵母模式菌株W303在YPD培养基和黄酒模拟液培养基进行发酵培养,监测黄酒酿造过程中2-苯乙醇生成过程,分阶段取样,并检测苯丙氨酸和苯乙醇的含量。研究发现:黄酒酵母的艾利希(Ehrlich)途径活力和莽草酸途径活力都很强。黄酒酵母HJ产生的2-苯乙醇主要来源于莽草酸途径。
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