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研究背景和目的卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其中卵巢上皮恶性肿瘤为最常见的卵巢肿瘤，其在妇科肿瘤中致死率最高。由于卵巢特殊的解剖学位置，所以卵巢癌患者早期常常没有明显症状，起病隐匿，临床中又缺乏有效的早期诊断，当确诊时大多患者已为晚期。目前理想的肿瘤细胞减灭术和术后以铂类为主的联合化疗是卵巢癌的标准治疗方案。多数患者可对首次术后的化疗敏感，但是随着化疗的进行，患者出现多药耐药，使卵巢癌患者的生存率仍未见明显提高。因此，对于如何实现耐药逆转、提高化疗药物敏感性一直是卵巢癌治疗研究的热点。钙结合蛋白S100家族中钙结合蛋白S100A4（S100calcium-binding proteinA4）是重要的成员之一。大量的研究证明，S100A4在许多恶性肿瘤中呈高表达，且被认为与肿瘤的发生发展、转移和侵袭、以及患者的预后相关的蛋白。我们推测S100A4在肿瘤基因治疗方面有不错的应用前景，可能成为逆转肿瘤耐药的靶点。本实验室在前期实验中，已证实在人卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780中S100A4呈低表达，而在顺铂耐药株CP70中呈高表达，用顺铂处理卵巢癌耐药株CP70细胞后，S100A4可以随着作用时间的延长，S100A4的表达量有上升的趋势；综合前期的实验结果，我们推测S100A4可能与卵巢癌耐药有密切关系。因此，本研究通过观察卵巢上皮癌患者癌组织标本中S100A4的表达，以及利用S100A4重组质粒转染卵巢癌A2780细胞和S100A4siRNA转染卵巢癌CP70细胞,即上调和下调S100A4基因的表达，继而检测卵巢癌细胞相应的生物学功能的改变，了解该基因与卵巢癌铂类耐药的相关性，为卵巢癌基因治疗提供新的思路。研究内容1.结合病人临床资料与美国妇科肿瘤学组分型建议，将卵巢上皮癌患者分为铂类耐药组和铂类敏感组，利用免疫组织化学法对S100A4基因进行检测，探讨S100A4与卵巢上皮癌耐药的相关性。2.利用细胞转染技术将S100A4-pEGFP-N1重组质粒和S100A4siRNA分别转入A2780细胞和CP70细胞；利用qRT-PCR和Western Blot分别检测转染后卵巢癌A2780细胞和CP70细胞中S100A4在mRNA和蛋白水平的变化；3. MTT法分别绘制卵巢癌A2780细胞和CP70细胞分别转染S100A4-pEGFP-N1重组质粒和S100A4siRNA后细胞对顺铂敏感性的变化；4.流式细胞术检测转染S100A4-pEGFP-N1重组质粒和S100A4siRNA后在顺铂作用下，S100A4上调或下调后对卵巢癌A2780细胞和CP70细胞凋亡的影响；5.流式细胞术检测转染S100A4-pEGFP-N1重组质粒和S100A4siRNA后对卵巢癌A2780细胞和CP70细胞周期的影响；6. Transwell法观察转染S100A4-pEGFP-N1重组质粒和S100A4siRNA后对卵巢癌A2780细胞和CP70细胞迁移侵袭能力的影响。研究结果1.卵巢癌中S100A4的表达明显高于正常卵巢组织，进一步发现卵巢癌铂类耐药组中S100A4高表达和核表达比例明显高于铂类敏感组患者，两者之间比较，差异有意义（P＜0.05）。2.利用qRT-PCR和Western Blot验证S100A4重组质粒S100A4-pEGFP-N1和S100A4siRNA分别有效的上调A2780细胞和下调CP70细胞中S100A4的表达。3.转染重组质粒S100A4-pEGFP-N1，MTT法检测转染后A2780细胞对顺铂敏感性显著下降（P＜0.05），上调S100A4的表达后，A2780细胞对顺铂的敏感性下降了约2.69倍。4.转染S100A4siRNA后CP70细胞对顺铂敏感性显著增强（P＜0.05），抑制S100A4的表达后，CP70细胞对顺铂的敏感性增强了1.90倍。5. S100A4-pEGFP-N1转染组和阴性对照组相比，细胞凋亡率下降；S100A4siRNA转染组和阴性对照组相比，凋亡率有所增加。6. S100A4-pEGFP-N1转染组与其他两组比较，G1期比例下降，G2+S期比例增加；在S100A4siRNA转染组中G1期比例增加，G2+S期比例下降。7. Transwell实验观察S100A4-pEGFP-N1转染组穿膜细胞数显著增多（P＜0.05）A2780细胞侵袭能力显著增强；S100A4siRNA转染组中穿膜细胞数显著减少（P＜0.05），CP70细胞侵袭能力降低。结论：在本实验中,研究发现在组织水平中S100A4在卵巢癌中多呈高表达，S100A4在细胞内的定位与卵巢癌患者铂类耐药具有相关性。利用实验室前期构建S100A4-pEGFP-N1重组质粒和S100A4siRNA从细胞水平观察对卵巢癌细胞生物学特性、转移和侵袭能力及铂类敏感性的影响。上调S100A4可增强卵巢癌细胞对顺铂的耐药性；并且上调S100A4的表达可进一步的为S100A4参与卵巢癌铂类耐药机制提供证据。