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研究背景与目的:蛇毒中含有多种多样的蛋白酶影响机体的凝血过程。其中,有一类丝氨酸蛋白酶,类似或部分类似凝血酶,能直接作用于纤维蛋白原(Fib)释放纤维蛋白肽A(FpA)或B(FpB),导致纤维蛋白单体首尾聚合而凝固,具有促凝活性,称之为“蛇毒类凝血酶"(snake venom thrombin-like enzymes,SVTLEs)。SVTLEs作为一种动物来源的蛋白酶类止血药因兼有毒性低、起效快、药效持久且不引起血管内栓塞等优点,而引发了国内外专家学者对SVTLEs类药物的研发热潮。第一个用于临床的SVTLEs类止血药是1963上市的注射用蛇毒血凝酶(商品名"立止血",Reptilase)。从上个世纪90年代开始,立止血在中国被广泛用于止血,包括各种手术出血、消化道出血和妇科出血等,并由此引发了国内开发SVTLEs类止血药物热潮。1998年初我国研究人员从华南尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出一种新的具有止血作用的活性组分——尖吻蝮蛇血凝酶;研究发现其为一种新的具有止血作用的SVTLEs,具有丝氨酸蛋白酶活性,含252个氨基酸,由α、β两个亚基构成,α、β两个亚基链间由七个二硫键连接。经过十多年的创新研究,尖吻蝮蛇血凝酶作为国家一类创新药物(注射用尖吻蝮蛇血凝酶,商品名“苏灵”,saculin)于2009年3月正式上市。“苏灵”采用全球领先的蛇毒单体提纯技术,使单一组分纯度达到99%,是迄今为止我国上市产品中唯一完成全部氨基酸测序的单一组分的SVTLEs类药物。前期研究表明,saculin作为高度纯化的单一蛋白,其止血作用机制主要是作用于纤维蛋白原释放FpA,不激活FXIII,临床应用表明其具有很好的止血作用,而且不良反应轻,耐受性好。本课题在其前期研究的基础上,将就saculin对凝血因子及其功能的影响进行进一步研究,以期更清楚的了解saculin的特性及其进入机体后对血液系统的影响,促进临床合理用药。方法和内容:1.尖吻蝮蛇血凝酶对凝血因子的水解作用特性研究1.1尖吻蝮蛇血凝酶对Fib的降解作用分别取 8 mg/ml Fib 0.25 ml,然后加入 0.25 ml 溶媒或 20 μg/ml saculin 或 2 ku/ml立止血或8 u/ml人凝血酶,混匀37℃水浴,于不同时间点取出样品加入5 mol/L尿素溶液0.5ml,振荡使凝块溶解,将样品进行SDS-PAGE分析。向上述各反应体系中分别加入5 μl 0.8 M的CaC12重复实验。1.2尖吻蝮蛇血凝酶对人标准血浆中Fib的降解作用分别取标准人血浆0.25 ml,然后加入0.25 ml溶媒或20 μg/ml saculin或8 u/ml人凝血酶,混匀37℃水浴,于不同时间点取出样品倾倒上清液,0.15 MNaCl冲洗凝块,然后加入5 mol/L尿素溶液0.5 ml,振荡使凝块溶解,将样品进行SDS-PAGE分析。向上述各反应体系中分别加入5 μl 0.8 M的CaCl2溶液重复实验。1.3尖吻蝮蛇血凝酶对人凝血因子XIII(FXIII)直接作用的研究分别取250 μl FXIII(0.6 mg/ml)溶液,然后加入250μl溶媒或20μg/ml saculin或2 ku/ml立止血或8 u/ml人凝血酶,37℃水浴不同时间后取出100μl样品,加入等量9M尿素溶液终止反应,进行SDS-PAGE分析。1.4 ELISA检测尖吻蝮蛇血凝酶裂解FXIII的产物的FXIIIa活性将Fib(40ug/ml)包被的酶标板,经封闭洗涤后依次加入60ul FXIII、10 ul saculin(400μg/ml)、10 ul 50 mM CaC12、100 ul 5 mM 生物素化戊胺和 10 ul 50 mM DTT,混匀后于37℃孵育,同时用凝血酶代替saculin作为阳性对照;于不同时间点,以100ul200mMEDTA终止反应,经洗涤后加入NeutrAvidin-HRP,37℃放置lh,显色,检测OD450。1.5尿素溶解实验检测尖吻蝮蛇血凝酶对FXIII的激活活性分别取 500 ul Fib(8mg/ml),加入 500 ul saculin(5 μg/ml)或 2 u/ml 人凝血酶或溶媒,然后在含或不含CaC12或者FXIII的条件下于37℃中孵育;待凝块形成30min后,倾倒上清液,滤纸吸干水分,称量凝块重量并记录,然后加入3 ml 5 M的尿素溶液,静置18h,观察并记录凝块溶解情况,称量凝块溶解后重量,计算溶解率。1.6尖吻蝮蛇血凝酶对凝血因子X(FX)水解作用的研究分别取 10 μl FX(1.33mg/ml),然后加入 50 μl 溶媒或 20 μg/ml saculin 或 2 ku/ml立止血或8u/ml人凝血酶,混匀37℃水浴,于不同的时间时点取出10μl样品,然后加入10μl10M的尿素溶液以终止反应,进行SDS-PAGE分析。1.7尖吻蝮蛇血凝酶对纤溶酶原水解作用的研究分别取10 μl人纤溶酶原(2 mg/ml),然后加入50 μl溶媒或20 μg/ml saculin或2 ku/ml立止血或8 u/ml人凝血酶或2 ku/ml尿激酶,混匀37℃水浴,于不同时间点取出10μl样品,然后加入10μl10 M的尿素溶液终止反应,进行SDS-PAGE 分析。1.8尖吻蝮蛇血凝酶对凝血酶原水解作用的研究分别取10 ul人凝血酶原(2.5 mg/ml),然后加入50 ul溶媒或20 μg/ml saculin或8 u/ml人凝血酶,混匀37℃水浴,于不同时间点取出20μl样品,然后加入等体积10M的尿素溶液终止反应,进行SDS-PAGE分析。2.尖吻蝮蛇血凝酶与Vik依赖凝血因子的结合特性研究2.1 NPAGE法定性验证尖吻蝮蛇血凝酶与富含GLa区的凝血因子的结合能力分别取24uMsaculin和 16uMFX(FXa)/FIX(FIXa)/FVII(FVIIa)/FII等体积混匀后于37℃孵育90 min后取出一定量的反应液立即进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(NPAGE)。2.2尖吻蝮蛇血凝酶与FX(FXa)/FIX(FIXa)形成的复合物中各组分分子比例的研究将 16uMsaculin 和 16uMFX(FXa)/FIX(FIXa)等体积混匀后于 37℃孵育90 min后取出一定量的反应液立即进行NPAGE分析。2.3 ELISA法定量检测尖吻蝮蛇血凝酶与富含GLa区的凝血因子的结合能力分别取 10 nM 的 FX(FXa)/FIX(FIXa)/FVII(FVIIa)/FII 包被酶标板,然后加入不同浓度的saculin溶液进行孵育,再加入saculin多克隆抗体和酶标二抗,加底物显色,酶标仪测OD值。2.4尖吻蝮蛇血凝酶对凝血酶原复合物、FX激活物复合物功能的影响研究通过自制模拟血小板第3因子的磷脂囊泡(PCPS),并将各复合物中所包含的凝血因子成分组建在一起,体外构建这三种复合物(凝血酶原复合物:1.4 uM FII+20 nM FVa+40 uM PCPS+3 nM FXa;外源性 FX 激活物复合物:0.5 uM FX+20 nMFIII+40uMPCPS+3nMFVIIa;内源性 FX 激活物复合物:0.5uMFX+40uM PCPS +FVIII-FIIa 混合物(8 IU/ml FVIII+16 nM FIIa)+ 3 nM FIXa),然后在saculin存在与不存在两种情况下对其功能进行检测。3.尖吻蝮蛇血凝酶的体内实验特性研究3.1新西兰兔血浆Fib含量的测定24只新西兰兔随机分为4组:阴性组、saculin 0.25μg/kg和0.125μg/kg组及巴曲酶对照组(0.5 BU/kg)。新西兰兔耳中动脉植入留置针,抽取给药前全血后,于耳缘经脉注射相应药物,阴性组给予溶媒0.9%生理盐水,然后抽取给药后0.5、1、2、4、6、12 h全血1ml,枸盐酸钠抗凝,3000转/min离心15 min,制备贫血小板血浆,测定血浆中Fib含量。结果与结论:1.经过长时间的作用(8 h以上),尖吻蝮蛇血凝酶能将纤维蛋白原的各亚基(包括共价交联形成的Y或者α聚合物)裂解成小碎片;2.尖吻蝮蛇血凝酶作用下形成的纤维蛋白单体也能在FXIIIa和钙离子的作用下形成共价交联(可能只形成Y链间共价交联);3.适量钙离子的存在可以使尖吻蝮蛇血凝酶发挥更好的凝固Fib作用;4.尖吻蝮蛇血凝酶不激活FXIII产生FXIIIa;5.尖吻蝮蛇血凝酶对FX、凝血酶原和纤溶酶原均无直接水解作用;6.尖吻蝮蛇血凝酶能与FX(FXa)/FIX(FIXa)按1:1的分子比例结合成复合物,与FVII(FVIIa)仅有很弱的结合能力,几乎不能与FII结合;7.尖吻蝮蛇血凝酶通过结合到FXa抑制其作用的发挥而抑制凝血酶原复合物的活性,同时尖吻蝮蛇血凝酶对内源性FX激活物复合物也有较明显的抑制作用,但是外源性FX激活物复合物的抑制作用较弱;8.0.25μg/kg和0.125 μg/kg尖吻蝮蛇血凝酶对正常新西兰兔血浆纤维蛋白原含量没有影响。