研究背景他克莫司(tacrolimus, Tac, FK506,商品名Prograf,普乐可复)是疏水性、中性大环内酯类新型免疫抑制剂,由日本藤泽(Fujisawa)制药公司于1984年首次从链霉菌肉汤培养基中分离得到,目前已能全合成。它的作用机制和环孢素相似,都是通过阻断T细胞受体介导的信号传导途径发挥作用,但免疫抑制方面是环孢素的10-100倍。由于它的分子量相对较小,可以穿透表皮屏障,为避免全身不良反应的发生,已制成外用制剂治疗各种免疫性和炎性皮肤病。在日本,1999年0.1%他克莫司软膏就被批准使用。在2000年7月,在加拿大NDS公司进行了Ⅲ期临床试验。美国FDA在2000年12月首次通过局部外用0.1%他克莫司软膏治疗成年人中重度特应性皮炎(AD),使用0.03%他克莫司治疗大于2岁的儿童和需要长时间间歇治疗的患者。2005年6月他克莫司软膏在中国上市,用于治疗多种皮肤疾病。外用他克莫司治疗特应性皮炎和其他T细胞介导的皮肤病具有良好的效果,并且没有外用糖皮质激素样的不良反应,深受皮肤科医师信赖。外用他克莫司常见的局部不良反应：烧灼感是最常见的不良反应,0.1%的他克莫司软膏发生率为31%-61%；0.03%浓度的他克莫司软膏约为33%-45%,个别患者用药后可以引起过敏性接触性皮炎、酒渣鼻样肉芽肿性发疹、Kaposi水痘样疹、病毒性疣等。口服他克莫司是肝、肾移植的一线药物,常见的不良反应有肾毒性和神经毒性,此外还有高血压、糖尿病、肥厚性心肌病、急性造血功能停滞、免疫过度抑制、颅内感染,以及恶心、呕吐、低磷血症、多尿症、高脂血症、感觉异常、视力障碍、皮肤异常等症状。但绝大多数外用他克莫司的病人不太可能出现像移植病人那样的高水平的系统暴露,仅有少数病人可能会出现低水平的系统暴露,AD是安全性研究最多的疾病,虽然随着治疗受累面积的增大,系统吸收也会增加,但是随着皮肤炎症和屏障功能的改善,他克莫司的吸收量也会随之减少,这可能是外用他克莫司不易产生系统性损害的一个原因。但基于Tac具有较强的免疫抑制作用和潜在的系统暴露问题,Tac长期使用的安全性问题倍受人们关注。由于缺乏长期安全性的资料和存在致癌的潜在风险,美国FDA要求外用他克莫司在包装上加黑框警告,这是FDA关于药物副作用最严厉的警告。根据Becker等病例报告和文献复习,在外用他克莫司使用者中,有19例出现癌症,包括16例成年和3例儿童(小于16岁)。肿瘤出现的时间在外用他克莫司治疗后的21-790天。肿瘤的类型9例为淋巴瘤,10例为皮肤肿瘤,包括鳞状细胞癌、皮肤肉瘤和恶性黑色素瘤,大多数皮肤肿瘤发生在使用药物的区域,肿瘤的发生和局部使用此药的持续时间和剂量有关。理论上,使用此药的时间越长,系统暴露(血药浓度)累积水平越高,肿瘤发生的机会就越大。固体脂质纳米粒(solid lip id nanoparticles, SLN)是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统,它是以固态的天然或合成的类脂如三酰甘油、卵磷脂等为载体,将药物包裹在类脂核中经不同方法制成的粒径在10～1000nm之间的固态胶粒给药体系。药物由于被包封于SLN的生理相容耐受性好的固体脂质骨架中,从而实现了更好的控释和缓释效果。制备纳米粒的材料较多,大致可分为聚合物和脂质材料,前者制成的纳米粒称为聚合物纳米粒(polymeric nanoparticles),后者称为固体脂质纳米粒(solid lip idnanoparticles,SLN)固体脂质纳米粒的优点有：(1)降低副作用,减少对局部应用的刺激性；(2)可同时增溶不同脂溶性的药物；(3)降低毒性和溶血作用；(4)药物分散性好,有利于吸收,提高生物利用度等优点。目前常用的固体脂质纳米粒制备方法有高压均质法、超声分散法、微乳法和溶剂挥发法等。而与这些方法相比,乳化蒸发法制备固体脂质纳米粒具有所用设备简单、操作简便、适合工业化生产、制得的固体脂质纳米粒粒径大小均匀和有较高的可重复性等优点,且无需均乳或超声等高能乳化过程,即实现了低能乳化,因此是一种值得推广应用的制备方法。SLN作为局部给药的主要优点是：避免化学不稳定药物的降解和调节药物的释放曲线,与口服给药相比,局部给药,可减轻系统的毒副作用。同时,由于SLN脂质生理相容性好,对皮肤无刺激；纳米粒微小颗粒使其紧密的接触角质层,使SLN具有良好的黏附性,可在皮肤表面形成连贯的具有闭塞效应的膜,闭塞效应还可增加皮肤的水合作用从而减少水分的散失,随着纳米粒粒径的变小或SLN局部浓度的升高黏附性增强,从而进一步增进皮肤的水合作用,提高药物对皮肤的渗透率。同时,SLN具有缓控释作用,在表皮、真皮形成药物储库,增加药物在皮肤组织中的滞留量,直接持久地对病变细胞起作用,降低药物的全身性吸收。国外研究者对固体脂质纳米粒在经皮给药系统中的应用进行了深入研究,克霉唑、维生素C棕榈酸脂、酮康唑、遮光剂、抗紫外线剂、咪唑类抗真菌药物、辅酶Q10以及抗关节炎药伐地考昔和塞来考昔已被成功制成局部用经皮给药系统,并取得了理想的药物释放效果和皮肤靶向作用。研究目的以硬脂酸作为他克莫司经皮给药载体,对其处方组成、制备工艺、形态、粒径、包封率、差示扫描量热、稳定性、体外释放进行研究。期望通过这种新型微粒给药系统用于皮肤局部给药,减少他克莫司经皮使用的副作用,同时使更多的药物贮留在皮肤内,以增加局部药物浓度减少系统吸收。研究方法1.处方前工作：本章确立了他克莫司的体外分析方法。经紫外扫描确定了药物的最大吸收波长为220nm,采用高效液相色谱法(HPLC法)测定固体脂质纳米粒中他克莫司的含量,最终确定检测条件：色谱柱：C18,流动相：乙腈-水-磷酸(700：300：1),柱温：50℃,检测波长：220nm,进样量：501μl。在此条件下进行一系列的标准曲线制备、精密度、回收率、重现性等试验验证HPLC方法适合他克莫司含量的测定。此外进行测定了他克莫司在不同介质中的溶解度及他克莫司的油/水分配系数,为后续制备工艺的选择提供参考；2.固体脂质纳米粒制备工艺的选择：固体脂质纳米粒常用的制备方法有微乳法、薄膜-超声分散法、乳化蒸发-低温固化法等。三种方法各有优缺点,通过制备方法的比较发现,乳化蒸发-低温固化法适合他克莫司SLN制备；通过考察不同的脂质载体、表面活性剂、有机溶剂的选择并进行正交设计实验筛选最优处方。3.他可莫司固体脂质纳米粒包封率测定的研究。分别采用鱼精蛋白法,低温高速分离、葡聚糖微柱凝胶法测包封率,最终确定适合本实验的方法为微柱离心法；并对微柱离心法进行一系列的验证：葡聚糖凝胶G-50对游离他克莫司的吸附、对空白脂质体的吸附及对固体脂质纳米粒样品中他克莫司的吸附。该方法准确可靠、快速简单、专属性好,适用于他克莫司SLN包封率的测定。4.对他克莫司SLN形态、粒径的观察及差示扫描量热法、X-衍射确定最后处方后药物在脂质体中的形态。5.他克莫司SLN稳定性研究：分别取3批制备好的他克莫司SLN样品,放置于室温和4℃冰箱,0、30、60天观察样品的外观及粒径的测量；将FK506-SLNs混悬液于15000rpm离心30分钟,观察有无药物结晶或脂质沉淀析出。6.取FK506-SLN混悬液及相同浓度的FK506原料药10ml,置于透析袋中(截留分子量12000-14000),两端夹紧后置200m1带塞锥形瓶中,加入释放介质(PH7.4PBS)100ml,将锥形瓶避光放入(37±2)℃恒温摇床中,每分钟振荡80次,于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60和72h时取样2m1,然后补加相同体积的PBS。将样液经0.45μm滤膜过滤,经HPLC测药物峰面积,并计算其浓度。按照公式Qn=Cn*VO+(C1+C2+C3+......+Cn-1)*V计算累积扩散释药量,并计算累积释药百分率,绘制体外释放曲线。3.统计学处理采用SPSS13.0软件和EXCEL进行数据统计,数据以X±SD表示,计算RSD值,采用[L27(34)]正交设计进行方差分析,当P≦0.05时,差异显著,有统计学意义。结果1.确立了他克莫司的体外分析方法。经紫外扫描确定了药物的最大吸收波长为220nm,采用HPLC法测定固体脂质纳米粒中他克莫司的含量,药物在1.6-80μg/ml范围内线性关系良好,得线性方程：A=32.2465C-1.1367(r=0.9998),最低检出限为：0.1μg/ml,日内、日间精密度RSD均小于1%,平均回收率为99-100.03%之间,方法简便、可行。2.测定了他克莫司在不通介质中的溶解度,为后续制备工艺的选择提供参考。他克莫司在生理盐水、0.1MNaOH、Birj78和油酸中的溶解度分别为0.9mg/ml、28.6mg/ml、1.8mg/ml和0.64mg/ml。结果表明他克莫司在油中不溶,在生理盐水和表面活性剂溶液中微溶,在0.1M NaOH中略溶。3.测定了他克莫司的油/水分配系数,其在PH为7.4的PBS中油/水分配系数为0.308,亲脂性较差,不易透过脂质屏障,因此药物本身透皮渗透较差。4.确定他克莫司SLN的制备方法：乳化蒸发-低温固化法,通过对单因素及正交设计的考察,最终制得稳定的他克莫司SLN乳液,测得粒径(134±18)nm,分散指数0.35,粒度分布窄；其表面带负电,zeta电位为(-30.8±1.44)mV,包封率为88.74%,投射电镜粒子成圆形或椭圆形,大小较均匀,无团聚现象,由DSC和X-衍射得出他克莫司以无定形的形态而非结晶状态包封于纳米粒中,在4℃存放60天的纳米粒粒径及包封率无明显变化变化,FK506-SLNs混悬液于15000rpm离心30分钟,离心后无分层,无药物结晶及脂质析出现象5.确定使用葡聚糖G-50微柱离心法分离未包括的药物测包封率。葡聚糖凝胶G-50对游离他克莫司的吸附游离药物吸附率为94.9%～97.5%。微柱对空白脂质体的回收率=C微柱后/C微柱前计算得回收率分别为91.4%、93.5%、96.8%和99.7%,RSD分别为0.76%、2.53%、1.28%和0.59%；微柱对固体脂质纳米粒样品中他克莫司的吸附率94.93-97.52%,RSD值0.31-0.9%。方法准确可靠,快速简单,测定固体脂质纳米粒包封率所需时间短,专属性好,样品用量少且稀释倍数小,适用用他克莫司SLN包封率的测定。6.他克莫司SLN体外释放实验：在前8h他克莫司原料药约96%药物释放出来,而他克莫司SLN中的他克莫司仅有55%释放出来,随后FK506-SLN表现为持续缓慢释放,在72h累计释放量约为86%。结论1.他克莫司体外分析方法方法简便、准确可行；他克莫司在水中的溶解度很低,要经皮给药,必须通过一定的方法增大他克莫司的溶解度,才能实现较好的透皮性能；他克莫司的油/水分配系数：其在PH为7.5的PBS中油/水分配系数为0.308,亲脂性较差,不易透过脂质屏障,因此药物本身透皮渗透较差。2.通过对多种包封率测量方法的比较,最后选择葡聚糖G-50微柱离心法分离未被包括的游离药物进一步测定包封率,方法准确可靠,快速简单,测定固体脂质纳米粒包封率所需时间短,专属性好,样品用量少且稀释倍数小,适用用他克莫司SLN包封率的测定。3.通过采用乳化蒸发-低温固化法制备他克莫司SLN,在单因素考察的基础上,采用正交设计优化、筛选最佳处方,并对优化条件下制备的他克莫司SLN进行了质量评价、DSC研究、体外释放和稳定性考察。结果表明,他克莫司适合以乳化蒸发-低温固化法进行SLN包裹,优化制备的他克莫司SLN混悬液的粒径、zeta电位及包封率均较为理想,并且在4℃冷藏条件下60天内理化性质基本稳定。