西瓜土传枯萎病是引起西瓜连作障碍的主要病害之一,严重影响西瓜产业的发展。嫁接作为防控土传病害、消除连作障碍的一项有效技术措施,在西瓜生产上已得到广泛应用。西瓜嫁接抗病的主要因素是抗性砧木的根系对病原真菌的低亲和性,但是仍然可以在嫁接后的非寄主植物根部发现病原菌。因此,对于嫁接的抗病机理,应该存在多种非排他性的解释。由于土传植物病原菌必须穿过根际才能侵染植物的根系,那么病原菌必须与根际的微生物发生相互作用。因此,研究嫁接西瓜的根际微生物特征及其形成机理,有利于从植物与微生物互作的角度进一步揭示嫁接西瓜的抗病机理,从而为深入指导防控土传病害提供科学依据。然而,西瓜嫁接后根系分泌物发生怎样的变化,这种变化会给根际微生物造成怎样的影响仍鲜有报道。因此,本文以非嫁接西瓜(W),葫芦为砧木的嫁接西瓜(WB),南瓜为砧木的嫁接西瓜(WP),砧木葫芦(B)和砧木南瓜(P)为材料,研究了西瓜嫁接对根系分泌物以及根际微生物的影响,获得了如下主要结果:1、本文从低分子物质和高分子物质两方面对嫁接对根系分泌物的影响进行研究。低分子方面,通过气相质谱(GC-TOF/MS)鉴定发现,嫁接显著提高了根系分泌物中低分子物质的香农指数和丰富度,以及oxoproline、N-Acetyl-5-hydroxytryptamine 1和6-hydroxy caproic acid dimer的相对含量。高分子方面,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离和液相质谱(LC-QTOF/MS/MS)鉴定,发现西瓜嫁接后根系分泌蛋白质谱发生了明显改变,嫁接显著提高了根系分泌蛋白的多样性。此外,还鉴定到一些嫁接后出现的与生物非生物胁迫抗性有关的蛋白,例如disease resistance protein At4g27190、callose synthase、HVA22 和 Clp protease。这些结果说明嫁接改变了西瓜根系分泌物的种类和相对含量,将有助于从根系分泌物的角度揭示嫁接促生和抗病的机理。2、水培条件下,对荧光标记的病原菌F.oxysporum f.sp.niveum(FON-gfp)以及本实验室筛选的两株拮抗菌SQR-21-gfp和SQR-9-gfp进行观察和计数,得出以下结论:病原菌方面,FON可以侵染嫁接和非嫁接西瓜根系的各个部位,并侵入维管束部位大量繁殖。说明嫁接抗病并非完全由于FON不能侵染葫芦根,仍存在其他补充因素。而非嫁接西瓜根部FON的侵染量随培养时间延长而增加;嫁接西瓜根部FON的侵染量随培养时间延长而减少,并且一直低于非嫁接西瓜根部FON的侵染量,这一结果进一步论证了本文第二章以及本实验室之前的研究所得出的结论,即嫁接后根系分泌了某些拮抗物质从而提高了宿主对FON的抗性。拮抗菌方面,与嫁接西瓜的根部相比,非嫁接西瓜根部可以招募更多的拮抗菌(SQR-9、SQR-21),表明嫁接抗病并非是由于嫁接西瓜招募了更多的拮抗菌,可能仍存在其他抗病机制。3、采用焦磷酸测序法,探讨在田间条件下根际细菌群落对西瓜嫁接的响应。结果显示,不同处理的根际细菌群落存在明显区别。与嫁接西瓜相比,非嫁接西瓜显著提高了潜在有拮抗菌属(如Bacillus spp.和Paenibacillus spp.)的相对丰度,表明嫁接西瓜并非通过招募更多的拮抗菌来发挥抵御土传病害的能力,这一发现与第三章的结论一致。嫁接西瓜根际细菌群落的香农指数显著高于非嫁接西瓜,这预示着嫁接西瓜根际细菌可能产生较大的生态位重叠,有利于抵御病原菌的入侵。综上所述,我们进一步证实了嫁接西瓜不是通过招募更多的拮抗细菌来发挥抗病性的,嫁接抗病可能还与根际细菌群落的多样性有关。4、基于以上研究结果,我们将研究对象扩展到五种植物类型(非嫁接西瓜、葫芦、南瓜以及嫁接在葫芦或南瓜上的西瓜),对其在田间实验条件下抗病性和微生物群落的关系进行了研究。通过气相质谱(GC-MS)和Illumina MiSeq测序分别分析根际化学物质和微生物群落结构的变化。用qPCR对FON定量并计算发病率。结果表明,与非嫁接西瓜相比,嫁接西瓜根际化学环境更加多样化,随之容纳了更加丰富多样的细菌和真菌群落。细菌的香农多样性与枯萎病发病率(r=0.832,p=0.005)以及病原菌数量(r=0.786,p=0.012)均呈显著负相关,说明根际丰富的细菌群落多样性可以抵御病原菌的入侵。此外,研究还发现甲基萘、庚烷和1,2-二甲基萘等化学物质对根际微生物群落中特定的微生物门和功能基因有显著影响。5、在连作的农田中,除了根系分泌物以外,西瓜植株分解产生的自毒物质也是导致西瓜连作障碍的主要原因,可抑制西瓜的生长,促进土传病原菌的入侵。然而,自毒素的组成和主要参与分解的微生物仍然未知。为此,我们设计了微宇宙实验,采用气相质谱(GC-MS)和稳定同位素探针变性梯度凝胶电泳(13C-DNA-SIP-DGGE)的方法,以确定西瓜植株残体加入连作土壤中7、14、30和45天后(dpi),直接参与分解过程的细菌以及产生的挥发性有机化合物(VOCs)。结果表明,在分解过程初期,结构较复杂的酚、醇和酯化合物如2,6-双(1，1-二甲基乙基)-4-(1-氧丙基)苯酚等的丰度增加,而在45dpi时,VOC的主要组分为具有简单结构的烯烃和烷烃,例如十二烷、石竹烯、十五烷等。在 7dpi 时,Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Firmicutes是参与残体分解的主要门类。从14到45 dpi,Gammaproteobacteria与Alphaproteobacteria占据主导地位。参与利用微宇宙中的13C-残体的总共有9个门类中的27个细菌种。研究结果增加了我们对于自毒植株残体分解的认识,并为通过对田间实践中的农作物残茬管理来减轻土传病害提供了理论依据。综上所述,西瓜嫁接后将在根际形成不同的化学环境,并招募更丰富多样的微生物群落。因此,根际丰富的细菌群落和抗真菌物质可以分别作为生物和化学屏障抵御病原菌的入侵。本研究的结果不仅有助于拓展我们对嫁接抗病机制的了解,还为今后通过人为改变根际化学环境从而调控根际微生物组成提供了思路。