论文部分内容阅读
目的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是导致人类化脓性感染最多见的病原菌,可导致皮肤及软组织的化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等,严重者可致败血症、脓毒症等全身性感染,危及生命。目前金黄色葡萄球菌的耐药现象普遍且呈多重耐药,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methecillin-resistant Staphlococcus aureus,MRSA),是医院获得性感染的重要病原菌,对临床绝大部分抗生素表现为耐药,可导致感染患者死亡。寻找一种新的抗菌制剂来治疗耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染,是提高患者治愈率,减少死亡的有效途径。肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是一种可以识别细菌细胞壁肽聚糖的模式识别受体,存在于微生物、昆虫、哺乳动物及人体内,在天然免疫应答反应中发挥重要的识别及调节功能。金黄色葡萄球菌的肽聚糖识别蛋白是金黄色葡萄球菌自溶素(autolysin,AtlA)的一个功能片段,位于酰胺酶(amidase)功能域内。自溶素是一种可降解细菌细胞壁的蛋白水解酶,含有酰胺酶和氨基糖苷酶两个功能蛋白,由细菌自身产生,参与细胞分裂、生物膜形成、表面黏附及细胞壁更新等细菌生长过程,自溶素对细胞壁的降解特性使得细菌难以对其产生抗性,这是其可以抑制耐药菌株生长的一大优势,但菌体正常生长状态下自溶素不表现出溶菌活性,活化机制不详。外源性的自溶素也同样具有溶菌活性,而且我们推测其中的肽聚糖识别蛋白可能是自溶素发挥溶菌作用的主要功能团。本研究采用基因工程技术获取金黄色葡萄球菌的重组蛋白PGRP,测定其对金黄色葡萄球菌尤其是耐药株的体外抗菌效应并初步探讨其抑菌机制,为其作为新型抗菌制剂的研究奠定基础。方法1.pgrp功能片段的预测及保守性和特异性分析:通过NCBI Conserved Domain Search预测,得到金黄色葡萄球菌自溶素AtlA中部分片段pgrp功能域的基因序列,并通过NCBI Blast在收录的金黄色葡萄球菌菌株中对相应的基因序列进行保守性分析,对临床分离的金黄色葡萄球菌菌株扩增pgrp,验证其保守性。根据GenBank中收录的金黄色葡萄自溶素AtlA基因序列(AC:D17366),设计其中pgrp基因片段的特异性引物,分别提取金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、肺炎克雷伯杆菌(ATCC700603)、大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、粪肠球菌(ATCC29212)及肺炎链球菌(ATCC49619)的全基因组DNA作为模板,采用PCR技术进行pgrp基因的扩增,以此来判断基因的特异性。2.获取金黄色葡萄球菌重组蛋白PGRP:以金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)基因组DNA为反应模板,应用PCR技术扩增得到目的基因片段pgrp,构建该基因的克隆质粒pEASY-T1/pgrp及表达载体pET-32а(+)/pgrp,转化至表达感受态菌BL21(DE3)中,通过IPTG的诱导表达产生重组蛋白PGRP。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及透析袋电洗脱技术分离并纯化重组蛋白。3.重组蛋白PGRP生物信息学分析:利用生物信息学相关软件(ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1 server、Signal-3L、TMpred、DAS、NetPhos 2.0 Server)分析重组蛋白PGRP的理化性质、信号肽、跨膜域及磷酸化位点等信息。4.体外抑菌实验:将临床表型耐药检测筛选的金黄色葡萄球菌耐药株再通过耐药基因mecA检测确定为MRSA 30株。取金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)及10株临床耐药菌株,采用微量肉汤稀释法测定重组蛋白PGRP的最低抑菌浓度(MIC)。以0.01M的灭菌PBS混悬30株金黄色葡萄球菌临床耐药菌株(终浓度为5×10~4CFU/ml),加入重组蛋白PGRP(药物终浓度为32μg/ml),分别测定1h、3h、5h及12h时间点时rPGRP对细菌生长的抑制作用,结果以SPSS20.0进行统计学分析。5.荧光定量PCR技术初步分析药物作用机制:根据金黄色葡萄的自溶素AtlA的基因序列(AC:D17366)中的pgrp基因片段设计一对特异性的荧光定量PCR引物,同时以16S RNA作为管家基因,以一定浓度的rPGRP作用于16株金黄色葡萄球菌临床耐药菌株12h后,分别以这16株菌株反转录合成的cDNA作为模板,比较rPGRP作用前后,即实验组(药物作用)及对照组(无药物作用)pgrp基因表达量的变化,初步探讨重组蛋白PGRP的抑菌作用机制。结果1.通过NCBI Conserved Domain Search预测获得功能域pgrp基因片段,约为476bp。NCBI Blast的对比结果显示,这段基因在GenBank所收录的金黄色葡萄球菌各菌株中均有存在,保守性较高,在临床分离株中也全部扩增出相应序列,验证了保守性。在选取的其他5株对照菌株中并未扩增出任何条带,证明选取的pgrp基因具有一定的特异性。2.成功构建重组质粒pEASY-T1/pgrp及表达载体pET-32а(+)/pgrp,构建的克隆质粒测序结果与GenBank中的金黄色葡萄自溶素AtlA基因序列(AC:D17366)的对比符合率为95.7%。诱导获得的rPGRP经SDS-PAGE电泳显示约为20kD,纯化后得到单一的蛋白条带。微量紫外分光光度计测得浓度为456μg/ml。3.生物学信息分析结果显示:金黄色葡萄球菌的rPGRP片段是由155个氨基酸组成,其相对分子质量为17440.95,理论pI为5.45,是一种稳定的亲水性蛋白,无信号肽且为非跨膜蛋白。4.rPGRP对金黄色葡萄球菌标准菌株的MIC为64μg/ml;对10株MRSA的MIC分别为64μg/ml(4株)、128μg/ml(1株)及>128μg/ml且<256μg/ml(5株)。根据抗微生物药物敏感性试验执行标准(2010 CLSI M100-S20)判断显示,该10株MRSA的药敏试验结果中青霉素MIC>8μg/ml及苯唑西林MIC>2μg/ml,均为耐药。体外抑菌试验显示,rPGRP对30株临床分离的MRSA均有一定的抑菌作用(在1h、3h、5h及12h时间点,相比于未加rPGRP的对照组,加入rPGRP作用后细菌计数显著降低,差异具有统计学意义,各时间点均为p=0.000<0.01)。5.实验组(加入rPGRP)及对照组(无rPGRP作用)荧光定量PCR结果显示,rPGRP作用于菌株12小时后,相较于对照组,实验组pgrp基因表达量增加,差异有统计学意义(p=0.000<0.01)。rPGRP可以增加MRSA株自身pgrp基因的表达量,可能与rPGRP对MRSA株的抑菌作用相关。结论1.pgrp基因在金黄色葡萄球菌中是具有高度保守性及特异性,可以通过基因工程技术构建pET-32а(+)/pgrp来表达获得重组蛋白PGRP。2.金黄色葡萄球菌重组蛋白PGRP对携带mecA耐药基因的MRSA菌株具有一定的抑菌作用,可能是通过促进菌株自身具有溶菌作用的基因(自溶素基因)的表达来发挥作用。PGRP有可能成为一种新型的抗菌药物,对抗耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染。