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背景:甲状腺癌（Thyroidcancer,THCA）作为目前最常见的内分泌系统癌症,其发病早期不易察觉,患者时常伴随声音沙哑、呼吸不畅等现象,严重时会影响患者的生活质量和生命安全。在临床上最常见的是甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）,约占所有甲状腺癌的90%。PTC患者一般预后较好,但是也存在少数早期PTC出现局部器官侵犯,颈部淋巴结转移或远处转移,这将严重减少患者总生存时间,并影响患者术后生存质量。随着分子生物学研究的发展,人们对于甲状腺癌的分子机制研究也逐渐深入,这有利于从生物学行为的角度,尤其是基因变异层面重新认识甲状腺癌的发生原因;此外,对于正确评估甲状腺肿瘤的良恶性和恶性程度也具有重要意义。针对特定基因的靶向治疗已成为除手术切除,TSH抑制治疗,碘-131治疗,放、化疗外,甲状腺癌治疗的新方法,且具有特异性强、副作用小等优点,为甲状腺癌的治疗带来了新途径。近年来,众多研究发现N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）在人类各种疾病发生发展过程中的作用,尤其是在肿瘤进展中扮演着相当重要的角色。M6A调控相关蛋白是m6A修饰得以发挥作用的重要因子,其表达水平的改变往往通过各种途径决定了肿瘤的病理学进展,如肝细胞肝癌、急性髓系白血病、脑胶质瘤、各种消化系统肿瘤等。在本研究中,我们主要探讨了甲状腺乳头状癌中差异表达的m6A调控蛋白IGF2BP2在甲状腺乳头状癌细胞功能调控中的作用以及相关机制研究,为未来开展更深入的研究提供了理论支撑。第一部分 基于TCGA数据库分析甲状腺乳头状癌的分子生物学特征目的:利用TCGA数据库中已有的RNA-seq数据展开分析,对甲状腺乳头状癌的分子生物学特征进行描述和总结,为研究甲状腺乳头状癌的发生发展提供较为全面的生物信息学指导。方法:1.从TCGA数据库中下载甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中（各56例）mRNAs和lncRNAs的基因表达谱,进行差异表达mRNAs和差异表达lncRNAs分析;2.对差异表达的mRNAs进行GO、KEGG富集分析。结果:1.从TCGA下载的56例PTC组织和对应癌旁组织样本的表达谱分析中筛选出差异表达的mRNAs共3178个,其中上调mRNAs 1861个,下调mRNAs 1317个;筛选出差异表达的lncRNAs共862个,其中上调lncRNAs有406个,下调lncRNAs有456个。2.对差异表达mRNAs的GO富集分析结果显示,差异表达基因主要参与调控上皮细胞增殖、上皮细胞侵袭、钙离子稳态、MAPK活性激活、Wnt信号通路等生物学过程。3.对差异表达mRNAs的KEGG通路富集分析结果显示,差异基因可能与肿瘤进程相关的有癌症中的转录失调、cAMP信号通路、p53信号通路、PI3K-AKT信号通路等。结论:1.PTC较正常组织,mRNAs、lncRNAs明显差异表达。2.PTC中差异表达的mRNAs,在多种肿瘤相关的生物学进程及通路中被显著富集。第二部分 IGF2BP2对甲状腺乳头状癌细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响目的:筛选在甲状腺乳头状癌组织中显著高表达的m6A调控基因,并验证其表达下调对甲状腺乳头状癌细胞生长发育的影响,以探究其在甲状腺乳头状癌进程中的作用。方法:1.利用Vlookup公式从第一部分实验中筛选出的3178个差异表达mRNAs中调取出18个m6A相关调控蛋白的基因表达谱,从中筛选出一个差异表达蛋白IGF2BP2;Ualcan及GEPIA数据库进一步验证IGF2BP2在甲状腺乳头状癌组织和正常组织中的表达情况,以及IGF2BP2表达与临床病理特征的相关性;2.对TPC-1和BCPAP细胞进行瞬时转染,筛选出干扰效果最好的IGF2BP2小干扰RNA,构建瞬时干扰IGF2BP2的PTC细胞系;3.CCK-8实验探究IGF2BP2干扰对PTC细胞增殖活力的影响;4.PI单染法流式细胞术分析IGF2BP2下调对PTC细胞周期的影响;5.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测IGF2BP2下调对PTC细胞凋亡的影响;6.Transwell细胞实验探究IGF2BP2干扰对PTC细胞侵袭和迁移能力的影响;7.裸鼠皮下移植瘤实验证实IGF2BP2干扰对肿瘤生长的影响,以及对ki-67/caspase-3/MMP9等标志物表达的影响。结果:1.通过调取18个m6A相关调控蛋白的表达谱,我们发现m6A阅读蛋白IGF2BP2在甲状腺乳头状癌组织中显著高表达（Log2FC=2.004,P=2.22E-32）,且高表达的IGF2BP2与肿瘤患者远处转移及淋巴结转移密切相关;2.qRT-PCR结果显示,与si-NC组相比,si-IGF2BP2#2转染显著抑制IGF2BP2表达（t=7.373,P=0.0018）;3.CCK-8结果显示,与si-NC组相比,干扰IGF2BP2可抑制TPC-1和BCPAP细胞增殖活力（双因素方差分析-多重比较,TPC-1:48h:P=0.0199;72h:P=0.0069;96h:P=0.0099,BCPAP:48 h:P=0.011;72h:P=0.0073）,表明IGF2BP2的下调会抑制PTC细胞的增殖。4.细胞周期结果显示,与si-NC组相比,干扰IGF2BP2可导致TPC-1和BCPAP 细胞周期受到阻滞（TPC-1:P=0.0038,BCPAP:P＜0.0001）;5.细胞凋亡结果显示,与si-NC组相比,干扰IGF2BP2促进TPC-1和BCPAP细胞凋亡（TPC-1:t=11.85,P=0.0003;BCPAP:t=64.99,P=0.0001）;6.Transwell结果显示,与si-NC组相比,干扰IGF2BP2抑制TPC-1和BCPAP细胞的迁移（TPC-1:t=13.93,P=0.0012;BCPAP:t=8.509,P=0.001）和侵袭（TPC-1:t=28.72,P=0.0001;BCPAP:t=9.95,P=0.0006）。7.裸鼠皮下移植瘤实验证实IGF2BP2干扰可抑制肿瘤生长以及ki-67、MMP-9表达,并促进caspase-3表达。结论:1.IGF2BP2在PTC肿瘤组织中较癌旁组织显著高表达;2.干扰IGF2BP2可抑制PTC细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞周期阻滞和凋亡。3.干扰IGF2BP2可抑制裸鼠肿瘤生长,并抑制肿瘤细胞活性和转移,促进肿瘤细胞凋亡。第三部分IGF2BP2通过调控HAGLR影响甲状腺乳头状癌细胞的生物学进程目的:筛选IGF2BP2下游调控的lncRNAHAGLR,并验证IGF2BP2是否通过调控HAGLR影响PTC细胞的生物学过程,以探究IGF2BP2调控PTC细胞进程的作用机制。方法:1.利用POSTAR3数据库筛选出和IGF2BP2有结合位点的lncRNAs;利用已有的甲状腺癌差异表达lncRNAs,用韦恩图筛选出既在甲状腺癌与正常组织中差异表达,又与IGF2BP2有结合位点的lncRNAs;通过查阅文献进一步筛选目标lncRNAs,利用Starbase数据库分析它们与IGF2BP2的表达相关性,以及这些lncRNAs在PTC肿瘤组织及正常组织中的表达。2.收集28对配对的临床PTC肿瘤组织及正常组织,qRT-PCR检测这些lncRNAs的表达水平,以及HAGLR表达与临床病理特征的相关性;3.在PTC细胞中干扰IGF2BP2,qRT-PCR实验检测IGF2BP2干扰是否影响HAGLR的表达;4.放线菌素D实验分析IGF2BP2干扰对HAGLR稳定性的影响;5.RIP-PCR 实验和 RNA pull-down-western blot 实验验证 IGF2BP2 与 HAGLR的相互作用;6.MeRIP-PCR实验验证IGF2BP2干涉是否影响HAGLR的甲基化水平;7.构建野生型及m6A位点突变型HAGLR荧光素酶质粒,并转染至TPC-1细胞中,双荧光素酶验证IGF2BP2过表达对野生或突变型荧光素酶活性的影响;8.细胞功能补救实验分析HAGLR的过表达是否可以逆转IGF2BP2干扰对TPC-1和BCPAP细胞活性、周期、凋亡、迁移、侵袭的影响。结果:1.韦恩图分析筛选出了 53个既与IGF2BP2有结合位点又在PTC中差异表达的lncRNAs,其中HAGLR、LINC00958与肿瘤发生发展密切相关;Starbase数据库分析显示它们与IGF2BP2的表达具有相关性;2.临床检测结果显示,与癌旁组织相比,仅HAGLR在PTC组织中显著高表达（t=3.126,P=0.0028）,且高表达的HAGLR与肿瘤患者淋巴结转移、原发肿瘤大小、肿瘤分期密切相关;3.qRT-PCR结果显示,与si-NC组相比,干扰IGF2BP2可抑制HAGLR表达（t=5.482,P=0.005）;4.放线菌素D结果显示,IGF2BP2干扰抑制HAGLR稳定性;5.RIP-PCR结果显示,与IgG组相比,IGFBP2抗体可显著富集HAGLR（t=8.833,P=0.0009）;RNA pull-down 结果显示,HAGLR 探针可富集 IGF2BP2蛋白;6.MeRIP-PCR结果显示,与si-NC组相比,干扰IGF2BP2可降低HAGLR的 m6A 水平（t=5.345,P=0.0059）;7.双荧光素酶结果显示,与pcDNA3.1组相比,IGF2BP2过表达可促进野生型HAGLR荧光素酶活性（双因素方差分析-多重比较,P=0.0007）,但对突变型HAGLR荧光素酶活性无显著影响。8.细胞功能结果显示,与si-IGF2BP2+pcDNA-HAGLR组相比,HAGLR过表达可明显逆转IGF2BP2干扰对细胞增殖（双因素方差分析-多重比较,TPC-1:24h:P=0.0066;48h:P=0.0001;72h:P=0.0001;96h:P=0.0001,BCPAP:48h:P=0.029;72h:P=0.0001;96h:P=0.0025）、周期（TPC-1:P=0.0005,BCPAP:P＜0.0001）、凋亡（TPC-1:t=11.85,P=0.0003;BCPAP:t=64.99,P=0.0001）、迁移（单因素方差分析-多重比较,TPC-1:P=0.0001;BCPAP:P=0.0001）和侵袭（单因素方差分析-多重比较,TPC-1:P=0.0003;BCPAP:P=0.0015）的影响。结论:1.HAGLR在PTC组织中较正常组织显著高表达,又与IGF2BP2存在相互结合,且其表达与IGF2BP2表达呈显著正相关性;2.IGF2BP2以m6A依赖的方式调控HAGLR表达及稳定性,进而影响甲状腺乳头状癌细胞活力、周期阻滞、凋亡、侵袭和迁移。