猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的全球性的猪传染性疾病。该病在1996年首次在中国报道,首个PRRSV分离株命名为CH-1a。2006年,中国出现了以NSP2蛋白不连续缺失30个氨基酸为特征的高致病毒株,命名为HP-PRRSV,该类型毒株给我国养猪业造成了巨大的损失。为了防控该病,多个弱毒疫苗被研制出来,VR2332-MLV、R98、JXA1-R、HuN4-F112、GDr180、TJM-F92和CH-1R弱毒疫苗株均为亲本株在Marc-145细胞上连续传代致弱而来。2006年以来,随着弱毒疫苗的广泛使用,HP-PRRS得到了有效的控制。然而,随着NADC30-like毒株于2013年在国内被报道,该病毒的流行情况变得复杂起来。1.新发PRRSV-2的基因组特征、细胞复制特性和致病力分析为了解2016年以来中国PRRSV的流行情况,本研究于2016年至2018年自中国中部和东部采集了 136份疑似感染PRRS V的组织样本,其中42份经RT-PCR证实为PRRSV-2阳性。ORF5和ORF6的系统进化分析结果显示:阳性样本中谱系8占比为18.38%,与QYYZ株密切相关的3个分离毒株属于新发的谱系3,其它3个分离株属于以NADC30为代表的谱系1。本研究中,4株PRRSV-2:JS18-3、ZJnb16-2、SDbz16-2、HNXX16被成功分离并进行了全基因组测序。基于全基因组进化分析结果显示:JS18-3属于与CH-1a亲缘关系更近的经典谱系8,ZJnb16-2属于与HP-PRRSV亲缘关系更近的谱系8,SDbz16-2、HNXX16属于谱系1。重组结果分析显示:ZJnb16-2是来源于谱系8（JXA1-like）和谱系3（QYYZ-like）的重组病毒,SDbz16-2是来源于谱系 1（NADC30-like）和谱系8（JXA1-like）的重组病毒,JS18-3是来自谱系8、1和3的三重重组病毒（CH-1a-like、NADC30-like、GDsg-like）,HXXX16无重组信号。细胞嗜性结果显示:ZJnb16-2、SDbz16-2、HNXX16均无法在Marc-145细胞上复制,而JS18-3在Marc-145细胞和PAMs上均可复制。其中,JS18-3基因组上4871-6635片段与HP-PRRSV代表毒株JXA1在核苷酸序列上具有99.3%的最高同一性,表明其正在向HP-PRRSV 进化。与CH-1a-like毒株JX07相比,JS18-3在Marc-145细胞和PAMs中复制速率显著增强并可导致更加严重的细胞病变效应。动物致病性实验结果表明:相比SDbz16-2,ZJnb16-2具有相对较强的致病力,JS18-3毒株的致病力明显强于经典8系病毒CH-1a,3株病毒均可引发仔猪出现持续性发热、呼吸困难、严重的肺部病变和淋巴结充血。本研究证实,新发谱系1和谱系3 PRRSV-2极易与其它谱系发生重组现象,重组导致出现新的致病性PRRSV-2,从而逃避常规疫苗引起的保护性免疫,亟待更新疫苗毒株和开发PRRSV-2通用疫苗。2.两种弱毒疫苗对ZJnb16-2株的临床保护效果及对新发PRRSV-2效力评价ZJnb16-2为新发的具有谱系3 PRRSV-2基因特征的重组病毒,本研究评价了 HuN4-F112和VR2332 MLV两种代表性弱毒疫苗对ZJnb16-2株的临床保护效果。疫苗免疫后血清病毒滴度测定结果显示:两种疫苗免疫猪只后7天、14天、21天都在血清中检测到疫苗病毒的存在。攻毒保护结果显示:与VR2332 MLV/ZJnb16-2和Mock/ZJnb16-2 组相比,HuN4-F112/ZJnb16-2免疫组猪只高热体温反应持续时间较短、平均日增重较高,临床症状较轻。在攻毒后21天,两种疫苗可减轻仔猪的病毒血症。但是,接种疫苗的猪只均出现不同程度的肺脏、淋巴结病变,微观病理变化可观察到肺部有大量炎性细胞浸润、支气管上皮细胞脱落。综上,VR2332 MLV和HuN4-F112均不能充分保护猪只抵御ZJnb16-2的感染。另外,弱毒疫苗免疫后在临床环境的持续存在也大大增加了疫苗株与流行毒株基因重组的概率,从而出现毒力返强问题。本研究从中和抗体和细胞免疫交叉反应性评价了当前弱毒疫苗对上述新发PRRSV-2的整体效力。首先,经7次免疫历时270天制备了针对PRRSV-2 HuN4-F112（谱系8）和JK-100（谱系5）的高中和效价血清,中和效价在1:16-1:64之间。PAMs上中和实验结果表明针对HuN4-F112和JK-100的中和血清均无法有效中和ZJnb16-2、SDbz16-2。JS18-3可以在Marc-145细胞上复制,利用针对HuN4-F112的4份中和血清评价对JS18-3的交叉反应,结果显示血清对JS18-3的中和效价仅为1:6-1:8。这些结果表明疫苗免疫后产生的中和抗体仅可中和亲缘关系较近的毒株,而对于新发的谱系1和3 PRRSV-2不具有交叉反应性。ELISPOT结果显示:在疫苗免疫仔猪后的21、28天血液中可检测到针对HuN4-F112、VR2332 MLV、ZJnb16-2、JS18-3、HNXX16的IFN-γ分泌细胞,数量有不同程度的差异（20-100个IFN-γ分泌细胞/106个PBMC）,这也证实了免疫疫苗后产生的细胞免疫对于当前国内的不同谱系PRRSV-2存在一定交叉反应性。由此可见,疫苗免疫后滞后且微弱的适应性免疫反应是弱毒疫苗交叉保护效力不足的重要原因。3.NSP1β点突变和NSP1随机突变的HuN4-F112疫苗株病毒拯救Ⅰ型干扰素对调节适应性免疫反应至关重要。然而,当前弱毒疫苗仍然可以抑制Ⅰ型干扰素的产生,这对疫苗病毒在宿主体内的存活具有巨大的益处,因此开发一种干扰素抑制功能减弱或者消除并且能够激发干扰素反应的疫苗将有助于改善其交叉保护效力。NSP1β是PRRSV重要的干扰素拮抗蛋白,其121-135位氨基酸与天然免疫抑制功能密切相关,因此我们选择NSP1β作为研究目标。首先以疫苗株HuN4-F112为模板,构建了该疫苗株的感染性克隆,转染Marc-145细胞后成功拯救出子代病毒。然后,基于HuN4-F112的感染性克隆,分别构建RR128129AA、KR124128AA、L126A、L135A 四种 NSP1β 蛋白编码区域的突变质粒,并成功拯救病毒。突变株在Marc-145细胞和PAMs细胞的生长特性表明:突变株在Marc-145的生长特性与亲本毒株无明显差异,然而,vRR128129AA、vKR124128AA突变株在接种PAMs后生长缓慢直至48 h被清除,而亲本株HuN4-F112、vL126A、vL135A随着时间的推移病毒复制逐渐增强。qPCR结果表明:vRR128129AA、vKR124128AA 突变株感染 PAMs 24 h 后,可引起 IFN-α、IFN-β和ISG15基因的上调表达。可见,突变的引入使得疫苗株病毒快速被PAMs清除,呈现一过性感染特征,并减弱了其天然免疫抑制功能同时激发了一定的天然免疫反应。综上,vRR128129AA、vKR124128AA突变株免疫后可能存在的毒力返强问题得到有效解决,激发的干扰素反应将有效调节适应性反应,未来可以作为PRRS防控新型候选疫苗株。为探究NSP1蛋白上多个干扰素敏感位点,本研究首先采用易错PCR方法成功扩增出NSP1编码基因,测序结果显示:每个克隆均含有6-8个不同位置的点突变。随后成功构建含NSP1随机突变基因的HuN4-F 112感染性克隆,阳性质粒中突变质粒占比为20%。将构建成功的部分重组质粒转染Marc-145细胞后成功拯救NSP1蛋白随机突变病毒,这为后续给予突变病毒干扰素压力后利用高通量测序技术来发现PRRSV NSP1上多个干扰素敏感位点打下坚实基础,也为PRRSV干扰素敏感疫苗株的研制提供了 一种新方法。4.PRRSV-2感染PAMs阻断单抗制备不同谱系PRRSV-2在感染靶细胞时所利用的受体是不变的,因此针对受体蛋白的单抗理论上可以阻断多个谱系病毒的入侵。pCD163是PRRSV感染PAMs的核心受体。本研究中,成功构建了 pFAST-HTB-pCD163-SRCR5-9重组杆粒,转染sf9细胞后,pCD163-SRCR5-9蛋白分泌表达于培养上清中。体外病毒结合试验结果显示,表达的pCD163-SRCR5-9蛋白可以与ZJnb17-1、HNXX16毒株结合,从而阻断病毒与PAMs表面受体的结合。表达的pCD163-SRCR5-9蛋白免疫小鼠后的血清经检测能够封闭PAMs表面PRRSV-2感染关键位点从而阻断病毒的感染。利用传统单克隆抗体技术结合IFA的方法筛选出12株针对该蛋白的单克隆抗体,其中单克隆抗体8H2和4H7对于来源于多谱系的PRRSV-2感染PAMs具有阻断作用,平均可使感染病毒的滴度下降100-1000倍,病毒拷贝数下降约104。表位鉴定结果显示,8H2、4H7单抗识别的部位分别位于pCD163蛋白的PSTI和SRCR6区域,识别的表位位于1-15位和1-30位氨基酸。研制的广谱阻断单抗可应用于临床中具有较高经济价值的感染母猪治疗。此外,PRRSV-2感染PAMs关键区域的鉴定,拓展了基因编辑技术在抗PRRS猪培育方面的应用。