论文部分内容阅读
[目的]构建复制型的含萤火虫荧光素酶（luciferase）报告基因的重组人3型腺病毒和含“四半胱氨酸”（tetracysteine,TC）标签的重组人4型腺病毒，为人3、4型可视化重组腺病毒的应用奠定基础。
[方法]
1.PCR扩增luciferase报告基因，克隆入去掉EGFP基因的人3型腺病毒穿梭质粒pSKA3E3LR（EGFP），经双酶切后与人3型腺病毒骨架质粒pBRAd3-EGFP的PCR扩增片段经重组酶Exnase体外重组的方法，得到中间载体，最后与pBRAd3-EGFP酶切片段连接，得到重组腺病毒质粒pAd3-LUC；转染AD293细胞，将包装成功的重组腺病毒rAd3-LUC纯化并免疫动物，分析重组腺病毒的特性和在小鼠体内的免疫反应。
2.通过对人4型腺病毒六邻体的氨基酸序列比对分析，设计TC标签（CCPGCC）嵌入六邻体高变区HVR1、HVR4或HVR5区上，以搭桥PCR扩增出各含TC标签的突变六邻体，与人4型腺病毒骨架质粒pAd4-DsRed的酶切片段经重组酶Exnase体外重组，得到含TC标签的重组腺病毒质粒；转染AD293细胞拯救重组腺病毒，将包装成功的重组腺病毒纯化并分析重组腺病毒的特性。
[结果]
1.采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到重组人3型腺病毒质粒pAd3-LUC，线性化的pAd3-LUC转染AD293细胞包装拯救得到重组腺病毒rAd3-LUC，观察到细胞病变和检测到luciferase蛋白的稳定表达，rAd3-LUC免疫小鼠抗血清可以识别并中和重组腺病毒rAd3-LUC（滴度约128～256）。
2.采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到3个重组人4型腺病毒质粒，线性化后转染AD293细胞，仅包装拯救得到TC标签嵌入HVR4区的重组腺病毒rAd4-DsRed-HR4TC，观察到细胞病变和红色荧光，其复制增殖特性与对照病毒rAd4-DsRed无显著差异，同时，可以通过荧光实时监测重组腺病毒感染细胞的过程。
[结论]
1.成功构建了表达荧光素酶报告基因的重组人3型腺病毒rAd3-LUC，为监控人3型腺病毒在人DSG2受体转基因小鼠体内复制及侵染等生命过程奠定基础。
2.成功构建了嵌有TC标签的编码基因的重组人4型腺病毒rAd4-DsRed-HR4TC，为研究抗人腺病毒六邻体中和抗体的中和作用机制奠定基础。
[方法]
1.PCR扩增luciferase报告基因，克隆入去掉EGFP基因的人3型腺病毒穿梭质粒pSKA3E3LR（EGFP），经双酶切后与人3型腺病毒骨架质粒pBRAd3-EGFP的PCR扩增片段经重组酶Exnase体外重组的方法，得到中间载体，最后与pBRAd3-EGFP酶切片段连接，得到重组腺病毒质粒pAd3-LUC；转染AD293细胞，将包装成功的重组腺病毒rAd3-LUC纯化并免疫动物，分析重组腺病毒的特性和在小鼠体内的免疫反应。
2.通过对人4型腺病毒六邻体的氨基酸序列比对分析，设计TC标签（CCPGCC）嵌入六邻体高变区HVR1、HVR4或HVR5区上，以搭桥PCR扩增出各含TC标签的突变六邻体，与人4型腺病毒骨架质粒pAd4-DsRed的酶切片段经重组酶Exnase体外重组，得到含TC标签的重组腺病毒质粒；转染AD293细胞拯救重组腺病毒，将包装成功的重组腺病毒纯化并分析重组腺病毒的特性。
[结果]
1.采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到重组人3型腺病毒质粒pAd3-LUC，线性化的pAd3-LUC转染AD293细胞包装拯救得到重组腺病毒rAd3-LUC，观察到细胞病变和检测到luciferase蛋白的稳定表达，rAd3-LUC免疫小鼠抗血清可以识别并中和重组腺病毒rAd3-LUC（滴度约128～256）。
2.采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到3个重组人4型腺病毒质粒，线性化后转染AD293细胞，仅包装拯救得到TC标签嵌入HVR4区的重组腺病毒rAd4-DsRed-HR4TC，观察到细胞病变和红色荧光，其复制增殖特性与对照病毒rAd4-DsRed无显著差异，同时，可以通过荧光实时监测重组腺病毒感染细胞的过程。
[结论]
1.成功构建了表达荧光素酶报告基因的重组人3型腺病毒rAd3-LUC，为监控人3型腺病毒在人DSG2受体转基因小鼠体内复制及侵染等生命过程奠定基础。
2.成功构建了嵌有TC标签的编码基因的重组人4型腺病毒rAd4-DsRed-HR4TC，为研究抗人腺病毒六邻体中和抗体的中和作用机制奠定基础。