束缚应激和Pg-LPS对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

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目的:检测束缚应激和牙龈卟啉单胞菌内毒素(Pg-LPS)对大鼠腹腔巨噬细胞释放NO、TNF-α、H2O2及IL-Iβ、IL-2、TL-6、IL-10等细胞因子的影响,了解束缚应激和Pg-LPS对大鼠腹腔巨噬细胞凋亡情况的影响,初步探讨应激影响牙周疾病的机制。方法:(1)第一部分:采用束缚应激方式,将SPF级雄性SD大鼠随机分为无应激组和应激组,于应激结束时常规收集腹腔液,用RPMI-1640培养液培养巨噬细胞,用贴壁法纯化巨噬细胞,并将细胞分为四组:正常对照组、Pg-LPS组、应激组和应激+Pg-LPS组,其中正常对照组和应激组用RPMI-1640培养液继续培养,Pg-LPS组和应激+Pg-LPS组用RPMI-1640培养液+1μg/mlPg-LPS继续培养,24小时后分别收集上清,测定上清液中NO、H2O2、TNF-α水平。(2)第二部分:采用束缚应激方式,将SPF级雄性SD大鼠随机分为无应激组、1天应激组及12天应激组,于应激结束时常规收集腹腔液,巨噬细胞培养及纯化等步骤同第一部分,细胞分为无应激组、1天应激组及12天应激组,均用RPMI-1640培养液+1μg/ml Pg-LPS继续培养,24小时后分别收集上清,用Luminex100检测仪测定上清液中IL-Iβ、IL-2、IL-6、IL-10等的水平。(3)第三部分:采用束缚应激方式,将SPF级雄性SD大鼠随机分为无应激组和应激组,于应激结束时处死动物、收集腹腔液、培养及纯化巨噬细胞等步骤同第一部分,巨噬细胞分为六组,分别继续用RPMI-1640培养液,RPMI-1640培养液+0.01μg/mlPg-LPS,RPMT-1640培养液+1μg/mlPg-LPS继续培养。于24小时后收集细胞爬片,采用荧光染色法、原位末端标记法(TUNEL)观察巨噬细胞的凋亡情况。结果:第一部分:应激组大鼠体重明显减轻(p<0.05)。应激组大鼠腹腔巨噬细胞总量减少(p<0.05)。Pg-LPS组NO水平比正常对照组显著增加(p<0.05),单纯应激组H2O2水平比正常对照组显著增加(p<0.05),应激+Pg-LPS组NO、H2O2、TNF-α水平比正常对照组显著增加(p<0.05)。第二部分:1天应激组各细胞因子水平与无应激组比较均无显著差异。12天应激组的IL-1β水平比无应激组显著增加(p<0.05)、IL-6水平比无应激组显著降低(p<0.05);IL-2水平比1天应激组显著降低(p<0.05)。IL-10在各组间差异无统计学意义(p>0.05)。第三部分:无应激、1μg/mlPg-LPS组及应激、1μg/mlPg-LPS组巨噬细胞的凋亡率较正常对照组明显提高(p<0.05),应激、1μg/mlPg-LPS组巨噬细胞的凋亡率较无应激、1μg/mlPg-LPS明显提高(p<0.05)。结论:(1)慢性束缚应激可引起大鼠体重减轻、腹腔巨噬细胞总量减少,慢性束缚应激和Pg-LPS可引起大鼠腹腔巨噬细胞所释放的NO、TNF-α、H2O2水平的改变;(2)1μg/mlPg-LPS刺激下,急性应激未引起大鼠腹腔巨噬细胞所释放的各细胞因子水平的改变,而慢性束缚应激可引起IL-Iβ、IL-2、IL-6等细胞因子水平的改变。(3)1μg/ml Pg-LPS可诱导大鼠腹腔巨噬细胞凋亡,束缚应激能加重这种异常。
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