一、研究背景脑胶质瘤是成年人中最常见的颅内原发肿瘤,尽管临床上具备手术联合放化疗等全面综合治疗手段,胶质母细胞瘤患者的中位生存期也仅为12-15月。其不容乐观的临床预后与胶质瘤自身浸润性生长的生物学特性有关,而瘤组织中微血管异常增生、高度血管化畸形在肿瘤的侵袭性生长过程中起重要作用。因此,肿瘤血管生成的相关研究一直成为热点。当前已在胶质瘤中得到证实并较公认的血管生成方式包括：血管共同选定(vascular co-option)、成血管细胞募集(vasculogenesis)和出芽式血管生成(angiogenesis)。随着研究不断深入,近年来又发现了一种与经典内皮依赖性肿瘤血管生成途径完全不同的血液供应方式—“血管生成拟态”(Vasculogenic mimicry, VM)。此概念于1999年由美国Iowas大学Maniotis和Folberg等根据对人眼葡萄膜黑色素瘤微循环的研究而提出,主要描述的是高度侵袭性肿瘤细胞通过自身可塑性和基质重构产生具有微循环功能的类血管样通道,通道内无血管内皮细胞衬覆,却能满足瘤组织血液供应。随后,在多种非黑色素瘤恶性肿瘤组织中,如乳腺癌、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、前列腺癌、脑胶质瘤等,都相继报道了血管生成拟态。2005年,Yue和Chen等人在45例星形细胞瘤患者中证实有2例标本存在血管生成拟态现象。他们利用CD34/PAS双重染色法对胶质瘤标本进行处理,发现某些标本中存在PAS阳性CD34阴性的网络状结构相互连结形成半闭合或完全闭合的环,中空的环状结构里面发现有红细胞和血浆。这些现象与Folberg等人提出的图案样基质型血管生成拟态描述完全一致。E1Hallani等在2010年使用CD34/PAS双重染色法观察胶质母细胞瘤中的微血管,也发现了一种与CD34+的内皮细胞依赖性血管不同的管道型血管。这种管道可见红细胞存在,但是其管道壁上衬覆的是CD34-的细胞。为了明确该管道的性质,研究者对病理组织标本进行连续切片的免疫组织化学染色观察,发现CD34+细胞构成的管道和CD34"细胞排列形成细胞的管道之间存在相连接的区域,并进一步证实了这种管道样血管实质上是内皮依赖性血管的延续。Shaifer等人提出胶质母细胞瘤(GBMs)中的VM存在与肿瘤的放疗抵抗有关。他们在三维器官型培养基上共同培养GFP转染的胶质瘤细胞和红色活性染料标记的内皮细胞,发现首先是内皮细胞形成血管结构,接着胶质瘤细胞在48小时内整合加入形成马赛克血管网络。在血管生成的条件下,胶质瘤细胞形成三维立体的血管网络,但是这些胶质瘤细胞始终未表达特异性内皮细胞分子,表明该血管样网状结构就是血管生成拟态(VM)。Liu等人认为血管生成拟态(VM)是影响胶质瘤患者预后的不良因素之一,同时有趣的发现瘤组织中的VM大多出现在微血管密度较低的区域,从而提出VM很可能是肿瘤新生血管的一种补充方式。该研究在探讨VM阳性患者的不良预后是否由胶质瘤WHO高级别所决定的时得出的结论却是,胶质母细胞瘤(WHOIV级)中是否存在血管生成拟态对其预后没有影响。但该研究样本量偏小,需要进一步研究来证实。目前普遍认为,肿瘤细胞的可塑性(tumor cell plasticity)是VM形成的关键环节,其相关机制还尚未完全明确。肿瘤细胞模拟其他类型细胞的基因表达和生物学行为的特性被称为“可塑性”,它是VM形成的分子基础。肿瘤细胞的可塑性,与细胞生长、粘附和形态的改变密切相关。细胞形态学上的改变往往能反映细胞的生长特性与功能的改变。而细胞骨架(cytoskeleton)是决定细胞形态的主要物质。正常情况下,细胞骨架与胞膜连接,与细胞外基质进行跨膜反应,控制膜受体及微丝粘着斑的活性状态,进而调节细胞的黏附和运动；而骨架系统结构的变化可干扰信号传导系统的工作,最终导致肿瘤细胞发生生物学性状改变。因此考虑胶质瘤细胞骨架结构的重塑与血管生成拟态(VM)发生过程中肿瘤细胞可塑性的形成密切相关。然而,国内外至今尚未见有关此方面报道。二、研究目的及意义本研究利用免疫组织化学和特殊组织化学结合的双重染色技术,观察63例人脑胶质瘤患者石蜡标本中血管生成拟态(VM)在胶质瘤组织中的生成特点,分析VM与胶质瘤患者的临床病理因素、临床预后转归的关系；并进一步检测胶质瘤组织中GFAP、Vimentin和Ki-67的表达,初步探讨它们在VM形成中的作用。旨在寻找影响胶质瘤患者预后的新指标,同时为抗肿瘤血管生成治疗提供新的思路及可能的靶点。三、实验过程1材料和方法1.1临床资料收集存档于南方医科大学珠江医院病理科2008年1月-2011年12月期间诊断为脑胶质瘤的石蜡标本63例。所选病例临床病理资料完整,患者在术前均未接受过放疗及化疗。其中男40例,平均年龄55±25.5岁,女23例,平均年龄54±31岁。依据中枢神经系统肿瘤WHO(2007)分级标准,包括WHOⅡ级17例,WHOⅢ级22例,WHOⅣ级24例。肿瘤大小以肿瘤切除的最大直径计算。以电话的方式对入选患者进行随访,随访时间从手术当天开始到死亡时间或2012年12月截止,中位随访时间为55周。术后生存时间为8-271周,中位生存期为67±12.19周。术后2周之内死亡不纳入生存分析中,因为其死亡可能是手术的并发症所致,不是疾病的自然进程。1.2实验试剂及方法采用免疫组织化学染色SP法,一抗分别为GFAP(即用型,兔抗人,编号ZA-0529)、Vimentin单克隆抗体(即用型,兔抗人,编号ZA-0511)、Ki-67(即用型,鼠抗人,7B11,ZM--0165)、CD34(即用型,鼠抗人,QBEnd/10,ZM--0046), SP试剂盒、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物公司。CD34/PAS双重染色方法,首先遵循免疫组化SP法进行GFAP、Vimentin、Ki-67和CD34染色,DAB显色后,进行PAS复染(高碘酸溶液及雪夫试剂购自于珠海贝索生物技术有限公司)。2. CD34/PAS双重染色结果判定CD34以血管内皮细胞胞质或胞膜出现棕黄色颗粒者为阳性,PAS阳性为染成浅粉色、紫红色或玫瑰红色。参照Maniotis等的标准,由CD34染色阳性的细胞及PAS阳性细胞外基质(ECM)构成的管道围成的管腔样结构提示为内皮依赖性血管；PAS阳性基底膜样物质和CD34阴性表达的肿瘤细胞围成的管道样结构,其内可以见到红细胞和(或)血浆,管腔周围未见出血、坏死、微血栓形成及炎性细胞浸润,该类结构判定为VM。3.免疫组化结果判定Ki-67以肿瘤细胞核内出现清晰棕黄色作为判断标准。在高倍镜下的肿瘤区内选取10个代表性视野(×200),计算阳性肿瘤细胞数占所有肿瘤细胞数的百分比成为Ki-67指数(Ki67labeling index, Ki67LI)。GFAP定位于细胞浆,Vimentin定位于细胞浆,采用二级计分法计数阳性细胞,在光学显微镜200倍视野下,随机选择5个视野,计数每个高倍视野中阳性细胞,按Shimizu等所采用的评分标准,根据表达阳性细胞比例及表达着色强度进行计分。阳性细胞百分比计分：0分为表达阴性,1分为阳性细胞数<5%,2分为阳性细胞数5%-25%,3分为阳性细胞数26%～50%,4分为阳性细胞数>50%。每张切片阳性细胞的着色强度按无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色分3分。再根据两项乘积作为判断表达结果,0分为阴性(-),1-2分为弱阳性(±),3-5分为阳性(+),6-7分为中等阳性(++),大于7分为强阳性(+++)。依据最终结果将GFAP和Vimentin分为两组：低表达组包括(-)、(±)、(+)和高表达组包括(++)、(+++)。4.统计学分析应用SPSS19.0软件包进行数据分析。频数资料采用四格表资料的χ2检验和两独立样本非参数检验,Mann-Whitney U检验方法比较差异。无进展生存期(PFS)为患者手术当天至首次发现疾病进展的时间,总生存期(OS)则为手术当天至死亡的时间,失访患者将在生存分析中作为删失数据处理。生存数据单因素分析用Kaplan-Meier法,并用Log-rank法进行差异显著性比较。应用Cox比例风险模型,研究多种因素对生存时间的影响。P<0.05表示差异有统计学意义。四、研究结果1、血管生成拟态(VM)存在于脑胶质瘤组织中：63例胶质瘤患者石蜡切片经CD34/PAS双重染色,显微镜下观察发现13例(13/63,20.6%)存在VM。镜下可观察到VM由CD34染色阴性的肿瘤细胞围成管道样结构,被一层PAS染色阳性的基质完整环绕,管腔内可见数量不一的红细胞,无红细胞渗出及血液凝固现象。衬覆于VM管壁的细胞呈多角形,胞核大而深染,核质比例增大证实为瘤细胞。在同一个视野中可见管腔内CD34染色阳性的内皮依赖性血管和具有红细胞的CD34阴性的VM。2、VM的存在与肿瘤组织的恶性程度及复发情况关系密切：VM在高级别脑胶质瘤组织中发生率(WHOⅢ,4/15,19%; WHOIV,8/24,33.3%)显著高于低级别患者(WHO Ⅱ,1/17,6.7%),其差异具有统计学意义(P=0.025)；VM阳性组患者的复发率(12/42,28.6%)显著高于VM阴性者(1/21,4%),两者差异具有统计学意义(P=0.008)。VM的存在与患者其他临床病理参数如年龄、肿瘤大小、手术全切程度之间并无明显相关性。3、脑胶质瘤组织中VM的存在与GFAP、Vimentin表达的关系：VM与在脑胶质瘤组织中GFAP的表达呈负相关(r=-0.478,P<0.05),而与在脑胶质瘤组织中Vimentin的表达呈正相关(r=0.336,P<0.01)。存在VM的胶质瘤组织中肿瘤细胞低表达GFAP,而高表达Vimentin(P<0.05)。4、脑胶质瘤组织中VM与Ki-67的表达的关系：在VM阳性组和VM阴性组病例中,Ki-67LI分别为24.73%±11.64%和9.95%±10.98%,两独立样本非参数检验两组差异具有统计学意义(Z=-4.74,P=0.000)(表2)。Spearman相关分析显示,VM与在脑胶质瘤组织中Ki-67的表达呈正相关(r=0.531,P<0.01)。5、VM与脑胶质瘤患者预后之间的关系：63例患者中有VM发生者13例,Kaplan-Meier法统计结果显示存在VM的患者术后无进展生存时间(PFS)和术后总生存时间(OS)均比VM阴性患者术后无进展生存时间(PFS)和术后总生存时间(OS)显著缩短,Log-rank检验法比较生存曲线的差别,两者差异具有统计学意义(P<0.05)6、COX比例风险模型多因素分析结果：肿瘤组织病理分级、VM的存在、GFAP的表达、Vimentin的表达和年龄是影响胶质瘤患者无进展生存的独立危险因素(P<0.05)；而肿瘤组织病理分级、VM的存在和Vimentin的表达是影响胶质瘤患者术后总生存时间的独立危险因素(P<0.05)。五、研究结论1、胶质瘤组织中存在血管生成拟态(VM),并且VM与肿瘤组织的发生、发展及侵袭、复发密切相关；2、胶质瘤组织中细胞骨架结构蛋白的改变(重塑)——GFAP低表达和Vimentin高表达可能协同促进血管生成拟态发生过程中肿瘤细胞可塑性的形成；3、胶质瘤中存在血管生成拟态(VM)的患者预后较差,VM是影响胶质瘤患者不良预后的独立因素；4、联合检测胶质瘤中VM、Ki-67、GFAP及Vimentin的情况,将有助于进一步评估肿瘤组织的恶性程度及复发危险性,并可作为判断患者临床预后的重要指标。