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研究目的:
体外研究产丙酮酸棒状杆菌(Corynebacteriumpyruviciproducens,C.pyruviciproducens)对抗原提呈细胞免疫功能的影响:进而以BALB/c小鼠为对象,探讨产丙酮酸棒状杆菌的免疫佐剂作用,为C.pyruviciproducens作为新的细菌性免疫佐剂积累试验数据。
研究方法:
(1)以痤疮丙酸杆菌(已经被广泛认可的细菌佐剂)为参照,产丙酮酸棒状杆菌刺激树突状细胞(Dendriticcell,DC)和巨噬细胞(Macrophage,Mφ)后,荧光定量PCR检测相关细胞因子mRNA水平的变化,ELISA检测其蛋白水平变化。
(2)通过MTT法检测产丙酮酸棒状杆菌对树突状细胞和巨噬细胞增殖的影响。
(3)流式细胞分析技术,检测产丙酮酸棒状杆菌对树突状细胞和巨噬细胞表面MHCⅡ和共刺激分子(CD40/80/86)等表达的影响,从而衡量产丙酮酸棒状杆菌对抗原提呈细胞成熟状态和功能的影响。
(4)以痤疮丙酸杆菌为对照,参考相关文献,以小鼠为免疫对象,建立产丙酮酸棒状杆菌对OVA(卵清蛋白)或SRBC(绵羊红细胞)免疫效应影响的试验方法,体内试验探讨产丙酮酸棒状杆菌分别在可溶性抗原和颗粒型抗原免疫应答中的作用。
(5)ELISA法检测不同免疫时期小鼠体内OVA特异性抗体的水平,通过改良溶血空斑试验检测免疫小鼠脾脏B细胞产生抗SRBC的能力,从而研究产丙酮酸棒状杆菌能否促进小鼠产生抗原特异性抗体。
(6)荧光定量PCR法检测免疫小鼠脾脏T-bet(Th1特异性转录因子)和GATA-3(Th2特异性转录因子),流式细胞分析技术检测脾细胞中Th1和Th2细胞所占的比例,ELISA法检测血清中IFN-γ和白细胞介素-4的含量,从不同角度衡量免疫小鼠体内的免疫状态,探讨产丙酮酸棒状杆菌能否促进小鼠的抗原特异性免疫应答。
研究结果:
(1)体外试验发现,与痤疮丙酸杆菌相比,无论mRNA水平还是蛋白水平,产丙酮酸棒状杆菌均能更有效地促进抗原提呈细胞产生和分泌白细胞介素-6、TNF-α、白细胞介素-12等细胞因子。
(2)MTT增殖试验结果显示,产丙酮酸棒状杆菌能有效促进树突状细胞和巨噬细胞的增殖。
(3)流式细胞分析技术分析抗原提呈细胞表面MHCⅡ和共刺激分子(CD40/80/86)表达情况表明,产丙酮酸棒状杆菌能明显增强MHCⅡ和共刺激分子(CD40/80/86)的表达水平,提示产丙酮酸棒状杆菌能促进抗原提呈细胞的成熟和抗原提呈活性。
(4)应用产丙酮酸棒状杆菌+OVA和产丙酮酸棒状杆菌+SRBC联合免疫BABL/c小鼠,建立了产丙酮酸棒状杆菌与抗原联合免疫方案,为研究其免疫佐剂功能奠定了良好的基础。
(5)ELISA检测小鼠血清中的OVA特异性抗体水平表明,产丙酮酸棒状杆菌和OVA联合免疫试验组中,OVA抗体水平明显高于对照组和痤疮丙酸杆菌实验组。在产丙酮酸棒状杆菌+SRBC联合免疫的小鼠,B细胞产生SRBC特异性抗体的能力增强,提示产丙酮酸棒状杆菌能有效提高BABL/c小鼠对不同类型抗原的抗体应答能力。
(6)在OVA/SRBC免疫小鼠,荧光定量PCR法显示,产丙酮酸棒状杆菌处理组小鼠脾脏GATA-3的水平明显高于T-bet;流式细胞分析技术证实脾脏淋巴细胞中Th2型细胞所占的比例升高;ELISA结果表明,血清中白细胞介素-4的含量也明显升高。
研究结论:
产丙酮酸棒状杆菌是一种新发现的棒状杆菌,是一种无芽孢、无动力、需脂的的革兰染色阳性的棒状杆菌,至今未发现其携带结核菌素、白喉毒素等已知的棒状杆菌毒素及其他致病性。本试验以痤疮丙酸杆菌为参照,通过体内、体外试验研究产丙酮酸棒状杆菌对小鼠免疫功能的调节作用和作为免疫佐剂的可能性。体外试验发现,产丙酮酸棒状杆菌能有效促进树突状细胞和巨噬细胞分泌相关细胞因子,如炎症因子白细胞介素-6和Th1型细胞因子白细胞介素-12等,能促进抗原提呈细胞的增殖,有助于抗原提呈细胞的成熟和活化及启动适应性免疫应答。体内试验表明,产丙酮酸棒状杆菌能很好地促进BALB/c小鼠产生OVA或SRBC特异性抗体、增强Th2免疫应答。简言之,产丙酮酸棒状杆菌能促进APC的活化和抗原提呈能力,调节适应性免疫应答,为产丙酮酸棒状杆菌免疫佐剂作用的开发应用,提供了理论支撑。