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细小病毒属于小DNA病毒,有的可以自主复制(如B19病毒、HBoV以及CPV、PPV),有的则需依赖其它辅助病毒才能复制(如AAV),可引起人类及动物多种疾病。自主细小病毒基因组序列有一些共同点,多数成员间核苷酸序列同源性较高。通常细小病毒具有宿主特异性,但是近年的一些研究结果表明,随着新的细小病毒突变株的出现及新的细小病毒的被发现,细小病毒的宿主特异性正在发生改变,在未来动物细小病毒有可能象SARS相关冠状病毒一样感染人类。目前我国儿童中主要存在B19病毒及HBoV感染,两者均可通过呼吸道传播。B19病毒可引起儿童第五病、急性再生障碍性贫血危象及急性血小板减少性紫癜等疾病,尤其是免疫功能低下或缺陷患儿可发生持续感染和慢性贫血,危及生命。HBoV是与牛细小病毒和犬极小病毒同属细小病毒亚科中的博卡病毒属,可引起儿童急性呼吸道感染。目前,国内外所建立的细小病毒检测技术是依据单株病毒或标准株的基因序列分析,不是一套各细小病毒株均可检测的快速生物检测系统,故大规模、快速检测细小病毒感染较困难。基因芯片技术为细小病毒的检测提供了一种快速、敏感、高通量、高效的临床诊断方法。因此有必要建立检测细小病毒的基因芯片,以便在细小病毒大规模流行时,最大限度地对所有可能成为传染源的细小病毒(包括插入变异的片段)进行检测。研究目的利用PCR技术制备B19病毒及HBoV等细小病毒特异性探针,在PCR循环过程中制备生物素标记的B19病毒及HBoV靶序列,为后续基因芯片的制备及检测奠定了基础。对B19病毒及HBoV的临床标本进行基因检测,对其临床特征进行分析,为B19病毒及HBoV感染的防治提供理论依据,并为细小病毒基因芯片的临床检测提供阳性样本。实验方法1.通过Genbank获得B19病毒、HBoV、CPV及PPV全基因序列及编码各蛋白的部分基因的基因序列号,针对上述基因分别进行BLAST及ClustalW分析,所得结果与相关文献对照,确定各细小病毒特异性基因区域。利用Primer Premier 5.0软件针对上述细小病毒基因组保守区域设计PCR特异性引物。2.利用PCR方法制备B19病毒、HBoV、CPV及PPV特异性探针,产物进行测序分析。3.以生物素标记的dNTP为底物,在PCR循环过程中制备生物素标记的B19病毒及HBoV靶序列。4.对2008年1月～2008年12月收集的252例以急性呼吸道感染住院患儿的血液标本和/或咽拭子、痰液标本进行了HBoV及B19病毒的检测,为细小病毒属基因芯片的特异性及临床检测提供阳性样本。5.分析B19病毒及HBoV呼吸道感染患儿的临床特点及流行病学特征。结果1.B19病毒、HBoV、CPV及PPV特异性探针及靶序列琼脂糖凝胶电泳检测时,均出现预期的明亮、单一条带。产物测序结果与标准株的变异小于1%。2.252份咽拭子及痰液标本中共检测到15份(6.0%)HBoV PCR阳性扩增产物,53.3%患儿合并有其它呼吸道病毒的感染,随机抽取1份HBoVNS1基因PCR阳性产物进行核苷酸序列测定,所测得的291bp核苷酸序列运用ClustalW软件与Genbank中的HBoV基因序列进行比较,结果显示:我们所获得的HBoV NS1测序的291bp与两个原型株HBoV Stockholml(stl,No.DQ00495)、HBoV Stockholm2(st2,No-DQ00496)和北京地区的2株流行株(No.DQ988934.2及No.DQ988933.1)的同源性大于99%。血液标本中未检出HBoV。3.在4例急性呼吸道感染患儿的咽拭子及痰液标本中B19病毒DNA检测阳性,其中有3例患儿伴有皮疹。结论1.针对简单、基因组较小的细小病毒,利用PCR技术制备细小病毒基因芯片的特异性探针及靶序列是一种快速、简单、低成本的实用方法。2.HBoV在15例以急性呼吸道感染住院患儿的咽拭子及痰液标本中检出,HBoV感染以下呼吸道感染为著,与其它呼吸道病毒有较高的合并感染,HBoV单独感染及其与其它呼吸道病毒的合并感染在临床特征方面无明显差别。血液标本中未检出HBoV。3.在急性呼吸道感染患儿的呼吸道标本中B19病毒DNA的检出率(1.6%)较低,但是这种使用非血液标本诊断急性B19病毒感染的方法值得尝试,尤其是对于儿童出疹性疾病的病原诊断。